一、概要
用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯免疫方法結合了色譜技術，采用AHD衍生物的特異性抗體，具有很高的精確度和靈敏度，較低的操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點在檢測中很好的表現出來。

二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物的AHD經衍生化后和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AHD代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。

三、適用范圍
 可定性、定量檢測動物組織（雞、豬、牛、魚、蝦等）、牛奶和蜂蜜中呋喃妥因代謝物的殘留量。

四、交叉反應率
呋喃妥因代謝物…………………………………………100%
呋喃唑酮代謝物…………………………………小于0.1%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于0.1%
硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小于0.1%
呋喃唑酮………………………………………………小于1%
呋喃它酮………………………………………………小于1%
呋喃妥因………………………………………………13%
呋喃西林…………………………………………小于1%

五、使用單位需自備的設備及試劑
設備：
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置
┅┅均質器
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：100ml、1L
┅┅玻璃試管：10ml
┅┅聚苯乙烯離心管：50ml
┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
┅┅乙酸乙酯(分析純)
┅┅正己烷（或正庚烷）(分析純)
┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)
┅┅甲醇(分析純)
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶樣用）
┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶樣用）
┅┅濃鹽酸
┅┅氫氧化鈉(分析純)
┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標板×1塊 （包被有偶聯抗原）
2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，0.1ppb，0.3ppb，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb
3、高濃度標準品：（1ml/瓶） 100ppb
4、酶標二抗         12ml …………………… 紅色帽
5、抗體工作液       7ml …………………… 綠色帽
6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽
10、2×濃縮復溶液      50ml……………………… 藍色帽
11、2-硝基苯甲醛      15.1mg…………………… 黑色帽

七、溶液的配制
配液1: 衍生化試劑
          向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。
配液2: C液（供奶樣用）：
0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
             稱取12.5g 二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水定容至100ml
      D液（供奶樣專用）：
1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液
             稱取29.8g 硫酸鋅用去離子水定容至100ml
配液3: 0.1M 磷酸氫二鉀溶液
           稱取22.8g 三水合磷酸氫二鉀加去離子水定容至1L。
配液4: 1M鹽酸溶液     
           量取8.3ml濃鹽酸加去離子水定容至100ml。
配液5: 1M氫氧化鈉    
           稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水定容至100ml。
配液6: 甲醇-水溶液
          量取甲醇90 ml加去離子水10 ml混勻。
配液7: 復溶工作液
用去離子水將2×濃縮復溶液按1：1體積比進行稀釋（1份2×濃縮復溶液+1份去離子水）用于提取樣本的復溶，復溶工作液在4℃環境可保存一個月。
配液8: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
   （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果
（c）衍生化試劑可于2-8℃保存半年。
（d）未處理的樣本冷凍保存。
（e）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時。
 （一）肌肉、肝臟、水產（魚蝦等）組織前處理方法
┅┅用均質器均質樣本
┅┅取1.0±0.05g的均質物至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入5ml甲醇-水溶液（見配液6），用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心10min，去除全部上清液；（本步驟可降低樣本基質干擾）
┅┅加入4ml的去離子水，用渦旋儀渦動溶解，加入0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接（四）描述方法（標 * 處）。
注：樣本應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存
 （二）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；
┅┅取出5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml玻璃離心管中；
┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液2）；
┅┅用振蕩器充分振蕩混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然后離心；
┅┅取牛奶的離心上清液1.1 ml（相當于1 ml奶樣），分別加入4ml的去離子水用振蕩器振蕩溶解，0.5ml 1M 鹽酸（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），充分振蕩2min；
┅┅接（四）描述方法（標 * 處）。
（三）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入4ml的去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接（四）描述方法（標 * 處）。
（四）接上面的方法
*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；
┅┅分別加入5ml 0.1M磷酸氫二鉀溶液（見配液6）、0.4ml 1M氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml的乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；
┅┅用1ml的正己烷（或正庚烷）用渦旋儀渦動30s，再加入1ml復溶工作液（見配液7），用渦旋儀渦動1min充分混勻；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅除去上層有機相，取下層水相50µl用于分析。

九、檢測步驟
測定前應須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣本：加入標準品/樣本50ml 到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液（見配液8）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標二抗：加入酶標二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min，取出重復洗板步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應15min（見注意事項8）。
9、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。

十、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃妥因代謝物的含量成負相關。
1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.236，樣本2的吸光度值為0.666，標準品吸光度值分別是： 0ppb為1.949；0.1ppb為1.434； 0.3ppb為.939； 0.9ppb為0.487； 2.7ppb為0.157； 8.1ppb為0.060。則樣本1的濃度范圍是0.9ppb-2.7ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
 B0 
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃妥因代謝物標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃妥因代謝物的實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
樣本稀釋倍數
魚蝦和肌肉肝臟樣品稀釋倍數：2
奶樣樣品稀釋倍數：2
蜂蜜樣品稀釋倍數：2

十一、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.1ppb
樣本最低檢測限：
組織、蜂蜜，牛奶樣品檢測下限………………………0.2ppb
蝦\魚等水產組織因存在一定的干擾，檢測下限在0.3ppb
準確度：
水產、肌肉、肝臟組織 ……………………………  75±15%        
蜂蜜樣本 …………………………………………  90±15%
奶樣………………………………………………  90±10%
精密度：
試劑盒的變異系數均小于10%

十二、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質的跡象
發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。
9、該試劑盒最佳反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

十三、貯藏條件及保存期
     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。

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