細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中最常用也是最重要的技術(shù)之一，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用以提供研究模型和實(shí)驗(yàn)材料。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)起到關(guān)鍵作用，決定實(shí)驗(yàn)成功與否。而血清是完全培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分之一，除為細(xì)胞生長提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、結(jié)合蛋白、一些參與解毒代謝的微量元素和可起到中和保護(hù)的酶類之外，還可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，因此被業(yè)內(nèi)認(rèn)為是細(xì)胞增殖過程中最重要的試劑。在生命科學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，動(dòng)物血清的應(yīng)用十分廣泛，特別是牛來源血清。而牛源血清又分為胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別方式主要由于牛齡和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗體水平含量低對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小、生長因子含量水平高利于細(xì)胞增殖而應(yīng)用最廣。因此關(guān)注胎牛血清的品級(jí)、質(zhì)量以及使用過程的一些注意事項(xiàng)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到直接影響作用，并可以確保科研人員在實(shí)驗(yàn)操作過程中的安全性。

今天我們就來看看在細(xì)胞培養(yǎng)過程中血清使用方面常見的問題，如：血清儲(chǔ)存條件、如何程序解凍、細(xì)胞污染與血清之間的關(guān)系、傳說中的“黑膠蟲”是什么以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通過今天的解析與學(xué)習(xí)可以讓我們?cè)谧黾?xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)事半功倍！那我們就開始吧~

Q1：血清長期儲(chǔ)存的條件和方法是什么？

A1：血清如需長期保存，則必須儲(chǔ)存于-10℃或更低溫冰箱中，建議存放于-20℃的冰箱中。研究表明儲(chǔ)存在-80℃條件下的血清在性能方面變化不大，但由于解凍時(shí)溫差過大，會(huì)導(dǎo)致析出更多沉淀，使得背景雜亂，因此血清長期保存不建議處于-80℃條件下。如果近期會(huì)頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過1個(gè)月；若一次無法用完整瓶，建議分裝后保存，且要避免反復(fù)凍融。另外，血清冰凍后體積會(huì)增加約10%，因此血清分裝時(shí)請(qǐng)留意預(yù)留一定的體積空間。

Q2：如何進(jìn)行血清的程序性解凍？血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損？

A2：程序性解凍血清可以確保血清制品質(zhì)量的穩(wěn)定性，且不會(huì)因?yàn)闇夭钸^大而析出過多蛋白等沉淀。程序性解凍方法是于實(shí)驗(yàn)開始之前將冷凍的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解凍過程中每隔1小時(shí)搖勻一次，使溫度與成分均一，減少沉淀析出，直至全部解凍，然后再移入室溫條件下使用。

Q3：血清解凍后發(fā)現(xiàn)絮狀沉淀該如何處理？

A3：造成血清發(fā)生絮狀沉淀的原因主要是血清解凍過程中溫差帶來的脂蛋白變性和纖維蛋白析出。沉淀本身不會(huì)影響血清質(zhì)量，也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。但如必須處理沉淀，則可通過離心方式去除，如500-1000g離心5-10 min。

Q4：血清沉淀是什么？

A4：用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清及其他血類制品中均存在各種類型的沉淀，如纖維蛋白和磷酸鈣等。一些絮狀沉淀主要就是纖維蛋白，通常我們?nèi)庋劭梢姡�大小�?-2mm之間；而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，通常被誤認(rèn)為是微生物污染。血清沉淀往往比較難以預(yù)測(cè)和控制，但幸運(yùn)的是這些沉淀不會(huì)影響血清品質(zhì)。

Q5：血清中的小黑點(diǎn)是“黑膠蟲”么？

A5：血清解凍過程溫差過大、經(jīng)反復(fù)凍融或通過熱滅活處理后更容易產(chǎn)生沉淀，這些沉淀物在鏡下觀察時(shí)有一些會(huì)呈現(xiàn)以布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)。業(yè)內(nèi)流行一種“黑膠蟲”污染的說法，但“黑膠蟲”一直以來都是極為神秘的存在，至今科學(xué)家們也沒有完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)它究竟是一種生物還是非生物，更有人認(rèn)為“黑膠蟲”是血清的原蟲，或誤以為是細(xì)菌或真菌污染。但科學(xué)家通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)它們更可能是血清中的蛋白結(jié)晶。這種結(jié)晶可能為蛋白析出，如纖維蛋白原凝結(jié)成纖維蛋白；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。

Q6：如何判斷血清污染？

A6：（1）首先檢查并判斷外包裝是否有破損，一般瓶身破損的血清發(fā)生污染的可能性極大；

（2）將血清接種到血酯板上，培養(yǎng)后看是否有菌落形成；

（3）可通過質(zhì)量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果判定，如支原體檢測(cè)試劑盒等。血清污染主要包括細(xì)菌污染、真菌污染和支原體污染。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)想要確定血清存在細(xì)菌污染，可嘗試使用5-10倍濃度青鏈霉素雙抗沖擊培養(yǎng)24-48h；真菌污染的細(xì)胞無法搶救，應(yīng)立即將細(xì)胞瓶進(jìn)行高壓滅菌處理，并徹底消毒培養(yǎng)箱；支原體污染可考慮更換早期代次細(xì)胞，或使用商品化支原體去除試劑。

Q7：細(xì)胞形態(tài)不正常、生長狀態(tài)異常或增殖速率緩慢是否與血清有關(guān)？

A7：細(xì)胞形態(tài)異常需要綜合關(guān)注細(xì)胞代次、傳代操作、培養(yǎng)基和血清等諸多因素。如傳代次數(shù)過多或傳代時(shí)間過晚都有可能影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。有些細(xì)胞對(duì)血清具有一定適應(yīng)性，更換新批次血清時(shí)可能出現(xiàn)所含因子水平的差異而導(dǎo)致的細(xì)胞生長狀態(tài)受到影響的現(xiàn)象，可以通過血清梯度替換或者增加細(xì)胞適應(yīng)時(shí)間來解決此類問題。與此同時(shí)也要關(guān)注基礎(chǔ)培養(yǎng)基和傳代操作等方面是否存在一定問題。

Q8：如何做血清的梯度替換？

A8：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需更換血清品牌時(shí)，做程序性梯度替換方案尤為重要，因?yàn)椴煌�品牌的血清所含成分有所差異，血清更換會(huì)使細(xì)胞發(fā)生不適，從而出現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢或細(xì)胞狀態(tài)不佳等情況。建議的梯度替換方法為：完全培養(yǎng)基配置過程中先用25%新血清與75%原血清進(jìn)行混合，培養(yǎng)傳代1-2次；而后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)傳代；再用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)傳代；最后完全使用新血清培養(yǎng)傳代。

Q9：培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后可長期保存嗎?

A9：新鮮培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后，建議在2周內(nèi)使用完。

Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?

A10：實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)熱滅活處理的血清對(duì)細(xì)胞生長可能僅有微小促進(jìn)或完全沒有任何作用，甚至通常因高溫處理而損失掉血清中部分營養(yǎng)成分從而影響血清質(zhì)量，造成細(xì)胞生長速率降低。熱滅活過程中因局部溫度過高、搖晃不均勻或滅活時(shí)間過長，都會(huì)造成血清品質(zhì)下降，且經(jīng)熱滅活后的血清會(huì)增加發(fā)生蛋白沉淀概率。因此，若非必須血清不需要做熱滅活，而少數(shù)對(duì)補(bǔ)體敏感的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)或腺病毒包裝等，可酌情對(duì)血清進(jìn)行熱滅活操作。

Q11：血清熱滅活應(yīng)如何操作？

A11：（1）熱滅活前，必須先將解凍后的血清搖勻，并恢復(fù)至室溫；

（2）取部分搖勻血清置于50ml離心管中，并準(zhǔn)備同規(guī)格對(duì)照管一個(gè)；

（3）對(duì)照管內(nèi)加入血清等體積水；

（4）對(duì)照管內(nèi)插入溫度計(jì)進(jìn)行溫度預(yù)試，當(dāng)溫度達(dá)到 56℃時(shí)將恢復(fù)至室溫的血清放入水浴鍋30min；

（5）滅活過程中需要每隔5min輕輕晃動(dòng)搖勻，以保證溫度均一。

Q12：血清為什么存在批間差？

A12：血清批間差是客觀存在的，因?yàn)檠�清制品來源于天然活體，供體牛只的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養(yǎng)環(huán)境的地形、風(fēng)貌、飲食、水源等影響，體內(nèi)各類蛋白、生長因子和酶類的含量均有巨大差異，所以血清具有含量復(fù)雜且不固定的特性，批間差異在所難免，因此批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量，確保細(xì)胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來的使用前測(cè)試，且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。

既然血清在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如此重要，那么我們又該如何選擇靠譜的血清呢？

1.中國海關(guān)允許進(jìn)口的血源地

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）對(duì)國家或地區(qū)動(dòng)物感染性疾病有相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)，如瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)GBR就是根據(jù)瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行地域性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及分類。目前世界上僅有一些少數(shù)國家在OIE對(duì)牛類風(fēng)險(xiǎn)性疾病的評(píng)估中符合中國海關(guān)要求，因此中國海關(guān)允許進(jìn)口的血清來源地有澳大利亞、新西蘭、烏拉圭，這些國家來源的牛血類制品的生物安全等級(jí)較高，科研人員在使用相關(guān)來源的血類制品時(shí)極大降低了感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，市面上其他血源地的血清都是非法走私血清，要選擇在瓶身明確標(biāo)注來源地的血清產(chǎn)品。

2.血源可溯性

由于血清利潤價(jià)值高昂、血源緊缺、不同原產(chǎn)國血清價(jià)格有差異、通過偽造血清來源從而進(jìn)行利潤賺取使血清用戶深受困擾等原因，使得血源可溯源至關(guān)重要。目前血清行業(yè)中有Oritain指紋識(shí)別技術(shù)，該技術(shù)可為每批血清進(jìn)行來源溯源認(rèn)證，有效證實(shí)血清產(chǎn)品來源。

3.國際機(jī)構(gòu)認(rèn)證

國際血清行業(yè)協(xié)會(huì)（ISIA）成立于2006年6月，旨在建立全球動(dòng)物血清和動(dòng)物源性產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)和確保血清和動(dòng)物源性產(chǎn)品供應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)和倫理規(guī)范，現(xiàn)已成為血清行業(yè)規(guī)范及血清供應(yīng)商身份驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的制定者。ISIA實(shí)施了供應(yīng)鏈可追溯性的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)確保血清各個(gè)批次的質(zhì)量、安全性和重復(fù)性起了關(guān)鍵作用。該組織在胎牛血清生產(chǎn)過程中主要對(duì)原料采集、血清加工、產(chǎn)品質(zhì)檢和出國運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控及認(rèn)證。

4.進(jìn)口合規(guī)性

合規(guī)的進(jìn)口血清應(yīng)該具備多項(xiàng)資質(zhì)證明文件，包括原產(chǎn)地證明、衛(wèi)生證/健康證/農(nóng)業(yè)部非疫區(qū)證明、進(jìn)口貨物報(bào)關(guān)單以及入境貨物檢驗(yàn)檢疫證明。其中原產(chǎn)地證明（CERTIFICATE OF ORIGIN）可以追溯貨物原產(chǎn)地或制造地，衛(wèi)生證/健康證/農(nóng)業(yè)部非疫區(qū)證明（ HC, HEALTH CERTIFICATE, TES/BSE）可以確保血清供體來源是健康、非疫區(qū)和無傳染病的。

5.嚴(yán)格質(zhì)控

由于牛血清在人用疫苗和獸用疫苗等生物制藥生產(chǎn)中非常重要，很多國家都將其納入藥典，在我國的中華人民共和國藥典Ch.P、美國藥典USP和歐洲藥典 EP 中都規(guī)定了牛血清的定義和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如內(nèi)毒素、總蛋白含量、血紅蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。此外，9種牛類傳染性疾病的檢測(cè)結(jié)果也十分重要，分別是牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、 牛細(xì)小病毒(BPV)、藍(lán)舌病毒(BTV)、 牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道腸道病毒(REO)等，這些病毒部分是人畜共患病，病毒檢測(cè)不合格的血清甚至?xí)�影響科研人員的健康與安全。因此我們要選擇質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照各國藥典要求，并遵循FDA頒布執(zhí)行的cGMP規(guī)范生產(chǎn)流程的血清供應(yīng)商，可在血清生產(chǎn)等各個(gè)環(huán)節(jié)保證產(chǎn)品質(zhì)量。

6.批間差異小

批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量，確保細(xì)胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來的使用前測(cè)試，且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。