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DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。
【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀（即DNA測序儀），采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP（標記終止物法），因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'''端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD（charge-coupled device）攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠（POP 6）和GeneScan膠（POP 4）。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1．BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2．pGEM-3Zf（+）雙鏈DNA對照模板0.2g/L，試劑盒配套試劑。
3．M13（-21）引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4．DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物 需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13（-21）引物，T7引物等。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管，蓋體分離，PE公司產品。
8．3mol/L 醋酸鈉（pH5.2）稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11．POP 6測序膠 ABI產品。
12．模板抑制試劑（TSR）ABI產品。
13．10×電泳緩沖液 ABI產品。
14．ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀。
15．2400型或9600型PCR儀。
16．臺式冷凍高速離心機。
17．臺式高速離心機或袖珍離心機。
【操作步驟】
1．PCR測序反應
(1) 取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標準對照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測的質粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf （+）雙鏈DNA － 1μl
待測DNA的正向引物 1μl －
M13（-21）引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數為96℃10s，50℃5s，60℃4min，25個循環(huán)，擴增結束后設置4℃保溫。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30min，小心棄上清。
(3) 加70%（V/V）的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．電泳前測序PCR產物的處理
(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。
(3) 在PCR儀上進行熱變性（95℃2min），冰中驟冷，待上機。
4．上機操作
按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kV預電泳5min，按編程次序自動進樣，再預電泳（1.2kV，20min），在7.5kV下電泳2h。電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。
5．儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。
6．測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。
【計算】
測序反應精確度計算公式：100%－差異堿基數（不包括N數）/650×100%
差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
【注意事項與評價】
1．ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。
2．本實驗測序PCR反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束后PCR液小于4～4.5μl，則此PCR反應可能失敗，不必進行純化和上樣。
3．作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產物需30～90ng，單鏈DNA需50～100ng，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp左右。本儀器DNA測序精確度為（98.5±0.5）%，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設計另外的引物。為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。對于N堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的精確度，根據星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進一步核對。
【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀（即DNA測序儀），采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP（標記終止物法），因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'''端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD（charge-coupled device）攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠（POP 6）和GeneScan膠（POP 4）。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1．BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2．pGEM-3Zf（+）雙鏈DNA對照模板0.2g/L，試劑盒配套試劑。
3．M13（-21）引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4．DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物 需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13（-21）引物，T7引物等。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管，蓋體分離，PE公司產品。
8．3mol/L 醋酸鈉（pH5.2）稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11．POP 6測序膠 ABI產品。
12．模板抑制試劑（TSR）ABI產品。
13．10×電泳緩沖液 ABI產品。
14．ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀。
15．2400型或9600型PCR儀。
16．臺式冷凍高速離心機。
17．臺式高速離心機或袖珍離心機。
【操作步驟】
1．PCR測序反應
(1) 取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標準對照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測的質粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf （+）雙鏈DNA － 1μl
待測DNA的正向引物 1μl －
M13（-21）引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數為96℃10s，50℃5s，60℃4min，25個循環(huán)，擴增結束后設置4℃保溫。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30min，小心棄上清。
(3) 加70%（V/V）的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．電泳前測序PCR產物的處理
(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。
(3) 在PCR儀上進行熱變性（95℃2min），冰中驟冷，待上機。
4．上機操作
按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kV預電泳5min，按編程次序自動進樣，再預電泳（1.2kV，20min），在7.5kV下電泳2h。電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。
5．儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。
6．測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。
【計算】
測序反應精確度計算公式：100%－差異堿基數（不包括N數）/650×100%
差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
【注意事項與評價】
1．ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。
2．本實驗測序PCR反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束后PCR液小于4～4.5μl，則此PCR反應可能失敗，不必進行純化和上樣。
3．作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產物需30～90ng，單鏈DNA需50～100ng，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp左右。本儀器DNA測序精確度為（98.5±0.5）%，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設計另外的引物。為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。對于N堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的精確度，根據星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進一步核對。
