01引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為宜。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

02酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

03dNTP的質(zhì)量與濃度　

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。

在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當(dāng)其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg²⁺結(jié)合，使游離的Mg²⁺濃度降低。

04模板(靶基因)核酸　

模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；

蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

05Mg²⁺濃度　

Mg²⁺對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg²⁺濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg²⁺濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。