在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；

緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機溶劑。當加入有機溶劑時，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。

對于液相常用濃度來說，緩沖液應維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右，當濃度特別稀的時候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個pH單位。

表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）

建議在開發方法的時候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調分離。這個策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。

1）建議溫度設置在25℃-40℃，適當的柱溫保持良好的保留時間的重現性，一定程度上提高柱效，增加分離度。

2）柱溫過低，流動相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。

3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對試劑或緩沖鹽對硅膠基質的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。

4）溫度的改變會導致保留時間漂移，如果儀器自動進樣過夜或過周末，就會發現保留時間隨著實驗室溫度的改變而產生漂移，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。