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在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
(1)要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨(PH 5.16)做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時就會出現(xiàn)不溶等。當(dāng)有機溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心；
(2)梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭上后會被強的溶劑洗脫出來，用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時產(chǎn)生氣泡；
(3)混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時常會出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時粘度會增大很多(甲醇-水體積比為1：1時壓力最大)，因此要防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力；
(4)每次梯度洗脫程序運行完之后必須對色譜柱進行徹底平衡，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)，需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相和初始流動相達(dá)到完全平衡，平衡不好會影響下一針樣品的分離度和保留時間：下圖所示的平衡時間從從上到下分別為6、7、8、9分鐘，可以看出平衡6、7分鐘第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8、9分鐘所有峰保留時間變化不大，說明色譜系統(tǒng)平衡充足；
(5)注意梯度洗脫用水的有機物殘留，往往在等度洗脫時用的水，在梯度洗脫時發(fā)生問題(鬼峰)，這是因為在梯度過程中，水占的比例很高時的流動相洗脫能力很低，此時水中的有機物殘留就被色譜柱吸附并濃縮，等到強溶劑占高比例時，濃縮的有機物被高洗脫能力的流動相洗脫而流出色譜柱，并成為一個色譜峰，從而干擾分析；
(6)梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器(如紫外吸收檢測器或熒光檢測器)，而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器(如示差折光檢測器)。
文章來源：網(wǎng)絡(luò)
(1)要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨(PH 5.16)做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時就會出現(xiàn)不溶等。當(dāng)有機溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心；
(2)梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭上后會被強的溶劑洗脫出來，用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時產(chǎn)生氣泡；
(3)混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時常會出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時粘度會增大很多(甲醇-水體積比為1：1時壓力最大)，因此要防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力；
(4)每次梯度洗脫程序運行完之后必須對色譜柱進行徹底平衡，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)，需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相和初始流動相達(dá)到完全平衡，平衡不好會影響下一針樣品的分離度和保留時間：下圖所示的平衡時間從從上到下分別為6、7、8、9分鐘，可以看出平衡6、7分鐘第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8、9分鐘所有峰保留時間變化不大，說明色譜系統(tǒng)平衡充足；
(5)注意梯度洗脫用水的有機物殘留，往往在等度洗脫時用的水，在梯度洗脫時發(fā)生問題(鬼峰)，這是因為在梯度過程中，水占的比例很高時的流動相洗脫能力很低，此時水中的有機物殘留就被色譜柱吸附并濃縮，等到強溶劑占高比例時，濃縮的有機物被高洗脫能力的流動相洗脫而流出色譜柱，并成為一個色譜峰，從而干擾分析；
(6)梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器(如紫外吸收檢測器或熒光檢測器)，而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器(如示差折光檢測器)。
文章來源：網(wǎng)絡(luò)
