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決定顯微鏡拍攝熒光照片質量的因素主要取決于像的襯度和像的亮度, 像的襯度是由樣品中激發出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過截止激發光的濾色片的雜散激發光, 樣品組織成分的自發熒光和光學系統的自發熒光和雜散光, 在熒光顯微術中盡全力要解決的是既獲得最佳的像襯度, 同時又維持像有足夠亮度, 這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發時僅利用了極少的光能, 背景暗了但熒光亮度也弱了。在應用時, 只能兼顧, 合理的權衡以決定取舍。
熒光顯微光學系統需要優先考慮的是:
(1) 光學系統組成的材料應選用在激發光波內無熒光材料, 不但指光學系統玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發熒光, 不但會增加背景光, 有時還會混淆觀察熒光圖像。
(2) 光學系統的參數選擇中, 應將獲得最大光能作為第一考慮因素。
照明系統中集光鏡應選用最大的包容角; 采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳, 以期望獲得高效率的均勻照明。
收集熒光成像的物鏡, 因為像面照度與數值孔徑NA 2 成正式, 為此作為熒光用物鏡應有較大的NA值。目前10×已達015; 20×達0175; 40×達019; 油鏡40×達113。
雙目鏡筒作為熒光用時應在可見光譜段有較高的透過率, 采用鍍膜技術可大大地減少光能的損失, 它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍, 這對弱熒光物質觀察是必須的。
目鏡放大率不宜選大, 因為象面照度與目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同, 當用613×目鏡時,照度定為100% , 換上1215×時, 照度約為25% , 因此常在4×～ 613×之間選用。
由此表明, 用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時, 象面照度和曝光系數可相差數倍, 對于熒光觀察最佳組合是選用低倍率目鏡和NA 大的物鏡最為合適。
(3) 作為熒光光學系統各組成部件的光譜特性也是至關重要的, 特別是紫外光要通過的部件, 如照明系統, 聚光鏡以及物鏡, 要關注紫光區的透射系數。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好, 因為鋁在UV 和V 區反射率在90% 以上, 而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線, 在紫外區通過處不宜用作膠合劑。
