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蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來(lái)源，具有不可替代的作用。含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的重要標(biāo)志。在檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，以此得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過(guò)程。
原理
樣品消化
蒸餾
吸收
滴定
注意事項(xiàng)
常見(jiàn)問(wèn)題解答
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機(jī)物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質(zhì)會(huì)分解為氨，然后氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來(lái)加快蛋白質(zhì)分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)，一般情況下，純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400℃以上。提高溫度使有機(jī)物加快分解。但是不能加入過(guò)多的硫酸鉀，否則會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，有機(jī)物全部消化完全后，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會(huì)轉(zhuǎn)化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測(cè)定結(jié)果，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強(qiáng)酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結(jié)合態(tài)的氨完全反應(yīng)并釋放出來(lái)，這個(gè)過(guò)程中的氫氧化鈉一定要過(guò)量，過(guò)量的氫氧化鈉會(huì)與硫酸銅生成藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗(yàn)蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會(huì)反應(yīng)生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時(shí)指示劑的變色反應(yīng)。溫度過(guò)高會(huì)使硼酸吸收液對(duì)氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過(guò)40 ℃。
待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須按照要求進(jìn)行配制和標(biāo)定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點(diǎn)時(shí)液體呈灰色。
一、消化過(guò)程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶?jī)?nèi)有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱(chēng)樣時(shí)需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結(jié)果偏低。消化過(guò)程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時(shí)搖動(dòng)定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來(lái)。搖動(dòng)的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側(cè)甩，使瓶?jī)?nèi)液體呈半旋轉(zhuǎn)半振蕩狀態(tài)，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點(diǎn)以及加堿蒸餾時(shí)的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個(gè)，分別為：
①催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現(xiàn)藍(lán)綠色澄清透明狀態(tài)。
③蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑：產(chǎn)生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時(shí)混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時(shí)混合。
五、請(qǐng)問(wèn)蒸餾的時(shí)取下錐形瓶，需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會(huì)有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結(jié)果誤差。蒸餾后移動(dòng)蒸餾液接收瓶,液面離開(kāi)冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開(kāi)電爐加熱，觀(guān)察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國(guó)標(biāo)的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時(shí)消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國(guó)標(biāo)給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當(dāng)減少稱(chēng)樣量，或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實(shí)驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時(shí)有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時(shí)含有多種蛋白質(zhì)，且折算系數(shù)不相同時(shí)可以按復(fù)合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。
結(jié)語(yǔ)：凱氏定氮法經(jīng)典、準(zhǔn)確，適用于食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定。但是因樣品中一般會(huì)含有一些非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果為樣品中粗蛋白質(zhì)含量。然而，此法實(shí)際上測(cè)的不是蛋白質(zhì)含量，而是通過(guò)測(cè)氮含量來(lái)推算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產(chǎn)生誤差的主要原因，因此要格外注意。在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，每一步應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定來(lái)進(jìn)行操作。本文為筆者日常工作實(shí)驗(yàn)總結(jié)所得，望對(duì)實(shí)驗(yàn)者有些許幫助。
