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流動相是影響液相色譜的關(guān)鍵因素。一個理想的液相色譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，選擇配制的方法不同，分析結(jié)果特別是保留時間，是會有顯著差別的。
高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液。常因資料上表示的內(nèi)容和實(shí)際的配制方法不同，而產(chǎn)生流動相的差異，影響了色譜圖和分析結(jié)果。
一般來說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進(jìn)行。溶液的體積因溫度而變化，所以按重量比混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。只要沒有特別標(biāo)明，就可按體積比進(jìn)行混合，但在特殊情況下，如胺類粘度高的溶液混合時，有時用重量-體積比（W/V）的方法。
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點(diǎn)：
1. 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。流動相溶解度達(dá)不到要求時，盡量選用流動相中含有的比例較大的成分，以減輕進(jìn)樣對流動相的影響造成基線不穩(wěn)。
2. 流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，選用流動相配置對色譜峰影響最小。
3. 流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
4. 流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。流動相組成溶劑均達(dá)不到要求時，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長內(nèi)無紫外吸收。
5. 流動相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
6. 在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
21項(xiàng)注意讓你更懂液相流動相
1. 選擇流動相應(yīng)注意過濾溶劑
溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試劑（緩沖鹽）配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇（反光面朝上），過濾水溶性流動相時（如甲醇/水），先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。
2. 注意保持儲液瓶的清潔
用普通溶劑瓶作流動相儲液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。
3. 注意保證溶劑的質(zhì)量
一定要用HPLC級的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。
4. 注意流動相脫氣不充分
流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。
可試用下列方法解決問題：
流動相再脫氣：采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。
系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡。
氣泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液存在于檢測器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測準(zhǔn)確性。所以做液相對流動相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。
氣泡會影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。
在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。
常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。
（1）氦氣脫氣：
氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護(hù)的流動相可以認(rèn)為是一個無氣體溶解體系。
其缺點(diǎn)是氦氣價格比較昂貴，會增加檢驗(yàn)成本。一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
（2）真空脫氣：
也是比較常用的脫氣方法。現(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動相，在使用過程中的微量脫氣。
（3）超聲波脫氣：
將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時還會引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。
超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），關(guān)于超聲時間問題眾說紛紜，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5～30分鐘不等，一般來說流動相組成為無機(jī)（緩沖鹽溶液）時，5～15分鐘即可，流動相為是水和有機(jī)容積混合時，超聲時間要相對長一些，這個方法只能除去30%的溶解氣體，時間的延長不和效果成正比，且其中氣泡對色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。
此法不影響溶劑組成。超聲時應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
（4）加熱回流脫氣：
該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對于有機(jī)溶劑或混合流動相不適合用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會損失掉，改變流動相的組成。
綜合來說，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是最常用的辦法，用氦氣的方法是效果最好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。
A. 離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
B. 在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。
5. 注意流動相供給不暢
流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。
應(yīng)經(jīng)常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動。
過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。
過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
使用下列方法解決：
（1）使用低流速；
（2）換大孔徑的過濾器；
（3）增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；
（4）抬高或加壓儲液器；
（5）不用過濾器，但流動相一定要先過濾；
（6）儲液器蓋子太緊，在儲液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙；
（7）進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。
6. 注意防止流動相和儲液器被污染
由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動相或系統(tǒng)用得太久（通宵）所造成的。
新加進(jìn)的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報(bào)廢儲液器。
流動相污染來自這幾個方面：
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試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格；
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微生物的影響；
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配制流動相時操作不當(dāng)?shù)取?/span>
因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級溶劑。
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要注意玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈；
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為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng)；
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懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）；
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真空脫氣時防止泵油帶入流動相；
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用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相；已經(jīng)污染的流動相一定要廢棄掉。
7. 注意選擇流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)
低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
8. 選擇流動相應(yīng)注意純度
色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。
9. 選擇流動相應(yīng)注意必須與檢測器匹配
使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
10. 選擇流動相應(yīng)注意粘度要低（應(yīng)<2cp）
高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長，最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動相。
11. 選擇流動相應(yīng)注意對樣品的溶解度要適宜
如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
12. 選擇流動相應(yīng)注意樣品易于回收
應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
13. 選擇流動相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱
一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）的比例。
14. 選擇流動相應(yīng)注意三倍規(guī)則
每減少10%的有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
15. 選擇流動相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)
當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
16. 流動相的配制注意有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合方法
有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合液作為流動相是經(jīng)常的，但由于混合方法不同，有時分析結(jié)果相差很大。如20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與乙腈10%的混合液，混合比為9∶1時，20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與乙腈10%的體積比為9∶1，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當(dāng)量稱取后進(jìn)行混合。
另外，按10%乙腈解釋，用20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5），將乙腈稀釋調(diào)制也可以成立。在后者情況下，產(chǎn)生混合體積減少部分，余下的添加20mM磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有太大的差別，但由于混合方式不同，分析結(jié)果，特別是保留時間，也會有顯著的差別，這點(diǎn)必須注意。
17. 50%或（V/V＝1/1）乙腈水溶液的配制方法
對于用V/V＝1/1的表示配制乙腈水溶液，多按這種方法進(jìn)行：用量筒測定乙腈500mL，用另一量筒測定水500mL，兩種液體在瓶內(nèi)充分搖晃混合。不過50%乙腈水溶液的表示時，同樣也多是按上述方法配制，但查化學(xué)辭典時，實(shí)際上是按這種方法進(jìn)行配制：首先將500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達(dá)到室溫，用全量水，使溶液到1L。
這樣一來，用%表示和“V/V”體積比表示，最終得出的流動相組成不同。也就是說，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計(jì)算的單純平均值不相同，所以用上述兩種方法調(diào)制的流動相組成差異。如在室溫（25℃）附近水50mL和乙腈50mL混合時體積不是100mL，而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡便的第一種方法。
18. 流動相的配制注意溶劑體積的溫度影響
溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷藏箱拿出來的溶液溫度與實(shí)驗(yàn)室的室溫相比要低不少，乙腈和水混合液因發(fā)熱反應(yīng)，溶液溫度升高。
因此，為能調(diào)制再現(xiàn)性好的流動相，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調(diào)到接近室溫。
19. 流動相的配制注意用兩臺泵進(jìn)行溶劑混合
雙泵主要是在探討流動相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時，建議配好后使用的話，混合比較均勻，效果較好。在反相分析中，常用的有機(jī)溶劑和水的等濃度法，使用高壓兩元梯度系統(tǒng)，用兩臺泵將流動相分別輸液后混合等封閉式混合時與預(yù)先在瓶內(nèi)混合后用1臺泵輸液時，因混合后體積變化的不同，保留時間也有所不同，一定要注意。
不僅是流動性的調(diào)制方法，試樣溶液和其他溶液的調(diào)制也經(jīng)常有上述問題，另外，在不同部門（醫(yī)藥部門或化工部門）各自都有自己的常識和習(xí)慣。在這種情況下，就要求各部門在制作相關(guān)溶液配制方法時能規(guī)定通則，定義設(shè)計(jì)溶液的調(diào)制方法，這樣避免混亂，以在日常工作中更好地記住這些表示方法。
20. 注意流動相的pH
如需在一定PH值下操作，須定期測定流動相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時這種影響可能更大。
21. 注意更換柱子及流動相
軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時應(yīng)先用25~30倍柱容積的合適流動相平衡。更換流動相時，如果兩種流動相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動相逐步溶解除去。例如，2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
