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色譜分析的重要作用之一是對樣品進行定量，色譜定量的依據是：組分的重量或濃度與檢測器的響應信號成正比。選擇合適的定量方法時，除需要考慮相對定量還是絕對定量外，同時也需要考慮化合物的線性響應范圍，是否有合適內標、是否有標準品等。今天我們來了解一下色譜是如何定量的。
在所有的色譜檢測器中，除了FPD之外，所有的檢測器都遵從線性響應，也就是說m=KS。這里m指單位時間內到達檢測器的待測物質的量（包括質量或物質的量），K表示線性響應系數，S表示檢測器響應信號的值。也就是說，檢測器響應信號的大小與單位時間到達檢測器的被測物質的總量成正比。當然我們也知道，這個關系是有范圍的，量太大或者太小，都會脫離線性。
2、其次就是第二條，塔板理論。塔板理論充分闡述了峰高與進樣量之間的關系，或者說他們之間是成正比的。這個可以參考對塔板理論的說明。
根據這兩條，可以肯定的說待測物質的峰高與待測物的進樣總量成正比�；蛘呃梦⒎e分可以推斷出待測物質的峰面積和待測物的進樣總量成正比。既然峰高和峰面積都與進樣總量成正比，為什么我們喜歡用峰面積，而不是更簡單的峰高呢？這個問題也很簡單，因為塔板理論不完全正確，峰形經常不完全滿足正態分布，所以峰高的代表性不足。什么時候峰高能夠有良好的代表性？很明顯，峰形良好而且對稱，成良好的正態分布曲線形狀的時候，或者說峰形尖銳且對稱的時候。色譜峰經常拖尾，所以用峰面積定量就可以了，峰面積絕大多數情形下都具有很好的代表性。但是在檢測器超載，或模數轉換器超載，或峰面積積分不準，或進樣代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面積也不能得到正確結果。但無論如何，用峰面積定量已經是我們可實行的最準確方法了。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應范圍、是否有合適內標、是否有標準品等。接下來就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法：面積歸一化法、外標法和內標法。
外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：
準確稱量W克樣品，再準確稱量Ws克內標物，加入至樣品中，混勻，進樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內標物的峰面積As，則i組分在W克樣品中所含的重量Wi，與內標物的重量Wi，有下述關系：
優點：①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內，定量結果與進樣量的重復性無關。②只要被測組分及內標物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質的含量。由于雜質(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內標法則很方便。
缺點：加一個與雜質量相當的內標物。加大進樣量突出雜質峰，測定雜質峰與內標峰面積之比，即可求出雜質含量。但樣品配制比較麻煩和內標物不易找尋。
以氣相色譜為例，氣相色譜是用峰面積或者峰高來定量的。依據如下：
1、最重要的第一條，就是檢測器的線性響應關系。
在所有的色譜檢測器中，除了FPD之外，所有的檢測器都遵從線性響應，也就是說m=KS。這里m指單位時間內到達檢測器的待測物質的量（包括質量或物質的量），K表示線性響應系數，S表示檢測器響應信號的值。也就是說，檢測器響應信號的大小與單位時間到達檢測器的被測物質的總量成正比。當然我們也知道，這個關系是有范圍的，量太大或者太小，都會脫離線性。
2、其次就是第二條，塔板理論。塔板理論充分闡述了峰高與進樣量之間的關系，或者說他們之間是成正比的。這個可以參考對塔板理論的說明。
根據這兩條，可以肯定的說待測物質的峰高與待測物的進樣總量成正比�；蛘呃梦⒎e分可以推斷出待測物質的峰面積和待測物的進樣總量成正比。既然峰高和峰面積都與進樣總量成正比，為什么我們喜歡用峰面積，而不是更簡單的峰高呢？這個問題也很簡單，因為塔板理論不完全正確，峰形經常不完全滿足正態分布，所以峰高的代表性不足。什么時候峰高能夠有良好的代表性？很明顯，峰形良好而且對稱，成良好的正態分布曲線形狀的時候，或者說峰形尖銳且對稱的時候。色譜峰經常拖尾，所以用峰面積定量就可以了，峰面積絕大多數情形下都具有很好的代表性。但是在檢測器超載，或模數轉換器超載，或峰面積積分不準，或進樣代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面積也不能得到正確結果。但無論如何，用峰面積定量已經是我們可實行的最準確方法了。
色譜定量分析，顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量，主要分為面積百分比法、歸一化法、外標法、內標法和標準加入法，色譜定量分析首先需要明確的概念是響應因子，不同的化合物在檢測器的響應是不一樣的，簡單地舉個例子說，相同濃度的化合物A和B，相同的進樣量，得到的峰高和峰面積不一定一樣的，響應因子的計算式如下：
式中，w為化合物的含量，A為響應值，一般為峰面積或峰高，以峰面積為例。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應范圍、是否有合適內標、是否有標準品等。接下來就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法：面積歸一化法、外標法和內標法。
01
歸一化法
由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產生信號，得到相應的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。
若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質及雜質的總量限度。
優點：簡便、準確、定量結果與進樣量重復性無關(在色譜柱不超載的范圍內)、操作條件略有變化時對結果影響較小。
缺點：必須所有組分在一個分析周期內都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產生信號。不適于微量雜質的含量測定。
缺點：必須所有組分在一個分析周期內都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產生信號。不適于微量雜質的含量測定。
02
外標法
用待測組分的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。
工作曲線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。
工作曲線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。
外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：
式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰面積。Ws及As分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面積。
優點：簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。
缺點：此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩定性的影響。
此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。
03
內標法
選擇樣品中不含有的純物質作為對照物質加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質的響應信號對比，測定待測組分含量的方法稱為內標法。“內標”的由來是因為標準(對照)物質加入到樣品中，有別于外標法。該對照物質稱為內標物。
在一個分析周期內不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內標法。
在一個分析周期內不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內標法。
準確稱量W克樣品，再準確稱量Ws克內標物，加入至樣品中，混勻，進樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內標物的峰面積As，則i組分在W克樣品中所含的重量Wi，與內標物的重量Wi，有下述關系：
待測組分i在樣品中的百分含量Ci％為：
對內標物的要求：①內標物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準確測量內標物的峰面積；②內標物的保留時間應與待測組分相近，但彼此能完全分離(R≥1.5)；③內標物必須是純度合乎要求的純物質。
優點：①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內，定量結果與進樣量的重復性無關。②只要被測組分及內標物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質的含量。由于雜質(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內標法則很方便。
缺點：加一個與雜質量相當的內標物。加大進樣量突出雜質峰，測定雜質峰與內標峰面積之比，即可求出雜質含量。但樣品配制比較麻煩和內標物不易找尋。
04
標準加入法
標準加入法實質上是一種特殊的內標法，是以待測組分的純物質作為內標，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入前后待測組分的峰面積（或峰高），從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例，標準加入法的計算如下：
式中，Δwi為加入的標準品的量，Ai為待測組分的峰面積，ΔAi為加入標準品后待測組分峰面積的增加量，wi為原樣品中待測組分的含量。
無論是何種定量計算方法都各有優缺點，沒有一種方法是一勞永逸，還應該根據樣品情況，具體情況具體選擇。
