步驟是：先在培養皿中倒一層不含細菌的基本培養基，待冷凝后，加一層含菌的基本培養基；冷凝后，再加一層不含菌的基本培養基，經培養出現菌落后，在培養皿底上相應的位置做上標記，然后加一層完全培養基。再經培養后出現的菌落，多數是只能在完全培養基中生長的營養缺陷型，上、下兩層基本培養基的作用是使菌落夾在中間，以免細菌移動或被完全培養基沖散。