如今，質粒載體中限制酶切位點的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點恰恰與外源ＤＮＡ片段本身毫無二致的載體。這就具備一個不可比擬的優點，也應是可以用相應的限制酶消化重組質粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產生匹配末端的任何位點中。例如，識別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的質粒中。這通常會使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下，用切點位于多克隆序列側翼的限制酶進行消化，可將片段從重組質粒中摘出。偶爾在質粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點之間，不可能找到“門當戶對”的搭配關系。這時可用下面兩種方案加以解決：
１）在線狀質粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
２）在得到控制的反應條件下，用大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補平帶3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點轉變為互補末端，從而促進載體和外源ＤＮＡ的連接。因為部分補平反應消除了同一分子兩端彼此配對的能力，故連接反應過程中環化和自身寡聚化的機會也會有所降低（Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986）。