资源新版在线天堂-桌下含校园污肉高h-坠落女教师-椎名由奈在线播放-六月色婷婷-六月丁香婷婷天天在线

VIP標識 上網做生意,首選VIP會員| 設為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
食品伙伴網服務號
 
當前位置: 首頁 » 食品專題 » 分子生物學技術 » 正文

外源DNA片段未的性質

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-04-26

 


1.帶有非互補突出端的片段

  用兩種不同的限制酶進行消化可以產生帶有非互補突出端的片段,刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數質粒載體均帶有由幾個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點。由于現有的多克隆位點如此多樣,因而幾乎總是能找到一種帶有與外DNA片段未匹配的限制切位點的載體。于是,采用所謂的定向克隆即可將外源DNA片段插入到載體當中。例如:載體pUC19用BamHl和Hind-Ⅲ進行消化,然后,通過凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段,以使同芤下來的多克隆位點 缺小片段分開。于是,這一載體就可以同有與BamHl和HindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源DNA區段相連接。用得到的環狀重級體化大腸桿菌,檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補,載體片段不能有效地環化,所以轉化大腸桿菌的效率也極低。因此,大多數具有氨芐表霉素抗性的細菌都含有帶外源DNA區段的質業,外源DNA區段成為連接HindⅢ和BamHI位點的橋梁。當然,可以根據特定的外源DNA區段來改變限制酶的組合方式。   如要制備定向克隆載體,它盡量避免使用大多克隆位點上彼此直接相鄰的限制酶切位點。這些位點中的一個被切開以后,第二個位點應位于線狀DNA分子一端的幾個堿基對之內,這樣過于靠近末端,不利于多種限制酶的有效切割。正因為如此,所以務必檢查兩種限制酶對載體的消化是否完全?刹捎靡韵聝煞N檢查方法: 1)用兩種限制酶中的一種對載體進行消化,當所用限制酶的最撻緩沖液對離子強度的要求有不同時,應使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后,應通過凝膠電泳對一小份DNA進行檢查。如所有質粒DNA均從環狀轉變為線狀分子時,適當調整鹽濃度,并加入第二種酶。同時,另行設立一個預實驗,其中含有環狀質粒DNA,并只加兩種限制酶中的第二種。當預實驗中的所有DNA都轉變為線狀(由凝膠電泳確定)時,通過凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質粒DNA大片段。\par 2)圖1.7所示的是檢查消化反應完全程度的一種更為嚴格的方法。對用第一個限制酶切割的一小份DNA進行末端標記,經離盡柱層析法純化后,與未標記的線狀DNA混合。然后用第二個酶消化,完全消化可使DNA小片段釋放,它應帶有50%的放射性活度,這可通過層析或通過凝膠電泳和放射自顯影加以檢測。

2。帶有相同末端(平端或粘端)的片段

  帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質粒載體中。在連接反應中,外源DNA和質粒都可能發生環化,也有可能形成串聯寡聚物。因此,必須仔細調整連接反應中兩個DNA的濃度,以便使“正確”連接產物的數量達到最佳水平(見本節三).此外,常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團以抑制質粒DNA的自身連接和環化。在體外連接反應中,僅當一個核苷酸含5'磷酸基團而另一個含3'羥基時,T4噬菌體DNA連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀DNA兩端的5'磷酸可以最大限度的地減少質粒DNA區段可有效地與去磷酸化質粒DNA相連接,產生一個含有兩個切口的開環分子(圖1.8)。因為環狀DNA(即使是帶切口的環狀DNA)的轉化效率比線狀DNA高得多,所以大多數轉化體都含有重組質粒。

3.帶有平端的片段

  外源DNA片段帶平端時,還有一樁切外生枝的麻煩事,這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的DNA要低得多。因此,涉及平端分子的連接反應所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質粒DNA的濃度都要高得多。還要說明的是,加入低濃度的如聚乙二醇一類的物質,常可提高這類反應的效率。

 
  • 下一篇:暫無
  • 上一篇:暫無
[ 網刊訂閱 ]  [ 食品專題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點擊排行
 
 
Processed in 0.013 second(s), 16 queries, Memory 0.88 M
主站蜘蛛池模板: 99在线视频免费观看视频| 久久久无码精品一区二区三区| 日本xxx在线观看免费播放| 国产乱妇乱子在线播视频播放网站 | 中文字幕亚洲乱码熟女在线| 午夜福利电影| 色窝窝亚洲AV在线观看| 中文无码熟妇人妻AV在线| 久久亚洲精品AV无码四区| 国产精品v欧美精品v日韩| 99精品观看| 一天不停的插BB十几次| 入室强伦女教师被学生| 嗯啊好爽视频| 久久re视频这里精品一本到99| 国产扒开美女双腿屁股流白浆| 365电影成人亚洲网在线观看| 亚洲大片免费| 日本中文字幕伊人成中文字幕| 噜妇插内射精品| 精品三级久久久久电影网1| 国产精品v片在线观看不卡| RAPPER性骚扰大开黄腔| 67194成网页发布在线观看| 亚洲精品在线免费| 卫生间被教官做好爽HH视频| 热巴两次用约老师屁股发底线球| 老师真棒无遮瑕版漫画免费| 娇妻中日久久持久久| 国产毛A片久久久久久无码| 德国美女密密麻麻浓毛| 中文字幕在线视频网站| 伊人成综合网伊人222| 亚洲成人一区二区| 性做久久久久久久久浪潮| 十分钟免费视频大全在线| 日本肉肉口番工全彩动漫| 清冷受被CAO的合不拢| 免费完整版观看| 国产中文字幕在线| 国产成人欧美日韩在线电影|