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高壓液相色譜

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

  Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設(shè)想,然而直到六十年代后期,由于各種技術(shù)的發(fā)展,高效液相色譜才付諸實(shí)現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜(HighSpeed Liquid Chromatography),高壓液相色譜(High Parss-ure Lipuid Chromatography),目前使用最多的名稱是高效液相色譜(High Pe-rformance Liauid Chromatography,HPLC)。高效液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用,成為一項(xiàng)不可缺少的技術(shù)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是⑴分辯率高于其它色譜法;⑵速度快,十幾分鐘到幾十分鐘可完成;⑶重復(fù)性高;⑷高效相色譜柱可反復(fù)使用;⑸自動(dòng)化操作,分析精確度高。根據(jù)分離過(guò)程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別,高效液相色譜可分為四個(gè)基本類(lèi)型,即液-固色譜、液-液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定:⑴氨基酸及其衍生物;⑵有機(jī)酸;⑶甾體化合物;⑷生物鹼;⑸抗菌素;⑹糖類(lèi);⑺卟啉;⑻核酸及其降解產(chǎn)物;⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽;⑽脂類(lèi)等。

一、分類(lèi)

  高效液相色譜法可分為四個(gè)基本類(lèi)型:即液-固色譜法,鍵合相色譜法,離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
(一)液-固色譜法
  液-固色譜法通常稱吸附色譜法,吸附劑有活性碳,氧化鋁和硅膠,在液-固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對(duì)溶質(zhì),分子的吸附能力不是平均分布在整個(gè)硅脫表面的,在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強(qiáng)烈相互作用,這些區(qū)域?yàn)榛钚晕恢,硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強(qiáng),而化合物在硅膠柱上的滯留時(shí)間也長(zhǎng)。在液-固色譜中,依靠流動(dòng)相溶劑分子與溶質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相互活性位置, 從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來(lái)。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng),因而稱強(qiáng)溶劑,反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點(diǎn)是適于分離色譜幾何異構(gòu)體,可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂,甾體化合物,脂溶性維生素,前列腺素等。
(二)鍵合相色譜法
  鍵合相色譜法是由液-液色譜法即分配色譜發(fā)展起來(lái)的。鍵合相色譜法將固定相共價(jià)結(jié)合在載體顆粒上,克服了分配色譜中由于固定相在流動(dòng)中有微量溶解,及流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊,固定相不斷損失,色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
  在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán),如一級(jí)氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑,如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性,因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng),洗脫能力也越強(qiáng),即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液-固色譜法相同,稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此,正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離,它不適于分離幾何異構(gòu)體。
2.反相色譜法
  在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔,如正辛基等。流?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。反相色譜法在高效液相色譜法中應(yīng)用最廣泛。 在反相色譜法中,使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用,在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí),溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用, 因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去。可見(jiàn)反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去,在色譜柱中滯留時(shí)間也長(zhǎng),所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物,亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外,反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物。可以通過(guò)改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH,以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用,改變它們的滯留行為。另外,反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大,可以/從0-100%,從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴,其鏈的長(zhǎng)短不同,最長(zhǎng)的是十八烷基,這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加,在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L(zhǎng)度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L(zhǎng)的反相色譜柱能得到較好的分辯率,在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來(lái)選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔铮苜|(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用,或者說(shuō)疏水相互作用,因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。水是極性最強(qiáng)的溶劑,也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑,向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑,以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相,這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈,此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
在生化分析中,反相色譜的應(yīng)用極廣。可用于①氨基酸和多肽的分析;②蛋白質(zhì)的分離;③堿基,核酸和核酸酶的分析;④甾體化合物的分析;⑤以及其他如幾茶酚胺類(lèi),組胺,糖及維生素的分離。
(三)離子交換色譜
  離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán), 這些帶電基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子,按照質(zhì)量作用定律,這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候,其可交換離子為陰離子,這種離子交換劑為陰離子交換劑;固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷,可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子,這種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑。陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是-NH2,及-MH3+ :陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是-SO3H及-COOH。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑,它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力;-NH2及-COOH 離子交換柱屬于弱離子交換劑,只有在一定的pH值范圍內(nèi),才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離,例如,氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱,多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離,核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。

二、易出現(xiàn)的問(wèn)題


(一)渦流擴(kuò)散(Eddy diffusion)
  流動(dòng)相碰到較大的固體顆粒,就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻,有的部分松散或有細(xì)溝,則流動(dòng)相的速度就快;有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢,多條流路有快有慢,就使區(qū)帶變寬。因此,固相載體的顆粒要小而均勻,裝柱要松緊均一,這樣渦流擴(kuò)散小,柱效率高。
(二)分子擴(kuò)散(Molecular diffusion)
  分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動(dòng),也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時(shí)在操作時(shí),如果流速太慢,被分離物質(zhì)停留時(shí)間長(zhǎng),則擴(kuò)散嚴(yán)重。
(三)質(zhì)量轉(zhuǎn)移(Mass transfer)
  被分離物質(zhì)要在流動(dòng)相與固定相中平衡,這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中,溶質(zhì)分子要在兩個(gè)液相之間進(jìn)行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時(shí)間。當(dāng)流速快時(shí),轉(zhuǎn)移速度慢,來(lái)不及達(dá)到平衡動(dòng)相就向前移,這各物質(zhì)的非平衡移動(dòng),使區(qū)帶變寬。
(四)動(dòng)相流速
  當(dāng)流速太低時(shí),分子擴(kuò)散嚴(yán)重,特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對(duì)流速作圖,理論塔板高度隨流速增加而急速下降,當(dāng)達(dá)到最低值時(shí),流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用,理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中,流速稍快影響不大,但在凝膠過(guò)濾色譜中,因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部,所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大,流速咖大會(huì)降低柱效率。
(五)固定相顆粒大小
  定相顆粒越小柱效率越高,對(duì)流動(dòng)相流動(dòng)的阻力越大,需要加大壓力才能使它流動(dòng)。

 

 
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