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放射性同位素的應(yīng)用-同位素示蹤法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

同位素示蹤法(isotopic tracer method)是利用放射性核素作為示蹤劑對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法,示蹤實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)建者是Hevesy。Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究鉛鹽在豆科植物內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移。繼后Jolit和Curie于1934年發(fā)現(xiàn)了人工放射性,以及其后生產(chǎn)方法的建立(加速器、反應(yīng)堆等),為放射性同位素示蹤法的更快的發(fā)展和廣泛應(yīng)用提供了基本的條件和有力的保障。

一、同位素示蹤法基本原理和特點(diǎn)

  同位素示蹤所利用的放射性核素(或穩(wěn)定性核素)及它們的化合物,與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)是相同的,只是具有不同的核物理性質(zhì)。因此,就可以用同位素作為一種標(biāo)記,制成含有同位素的標(biāo)記化合物(如標(biāo)記食物,藥物和代謝物質(zhì)等)代替相應(yīng)的非標(biāo)記化合物。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì),就可以用核探測(cè)器隨時(shí)追蹤它在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等,穩(wěn)定性同位素雖然不釋放射線,但可以利用它與普通相應(yīng)同位素的質(zhì)量之差,通過(guò)質(zhì)譜儀,氣相層析儀,核磁共振等質(zhì)量分析儀器來(lái)測(cè)定。放射性同位素和穩(wěn)定性同位素都可作為示蹤劑(tracer),但是,穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低,可獲得的種類(lèi)少,價(jià)格較昂貴,其應(yīng)用范圍受到限制;而用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度,測(cè)量方法簡(jiǎn)便易行,能準(zhǔn)確地定量,準(zhǔn)確地定位及符合所研究對(duì)象的生理?xiàng)l件等特點(diǎn):
1.靈敏度高
  放射性示蹤法可測(cè)到10-14-10-18克水平,即可以從1015個(gè)非放射性原子中檢出一個(gè)放射性原子。它比目前較敏感的重量分析天平要敏感108-107倍,而迄今最準(zhǔn)確的化學(xué)分析法很難測(cè)定到10-12克水平。
2.方法簡(jiǎn)便
  放射性測(cè)定不受其它非放射性物質(zhì)的干擾,可以省略許多復(fù)雜的物質(zhì)分離步驟,體內(nèi)示蹤時(shí),可以利用某些放射性同位素釋放出穿透力強(qiáng)的r射線,在體外測(cè)量而獲得結(jié)果,這就大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程,做到非破壞性分析,隨著液體閃爍計(jì)數(shù)的發(fā)展,14C和3H等發(fā)射軟β射線的放射性同位素在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
3.定位定量準(zhǔn)確
  放射性同位素示蹤法能準(zhǔn)確定量地測(cè)定代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變,與某些形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合(如病理組織切片技術(shù),電子顯微鏡技術(shù)等),可以確定放射性示蹤劑在組織器官中的定量分布,并且對(duì)組織器官的定位準(zhǔn)確度可達(dá)細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平乃至分子水平。
4.符合生理?xiàng)l件
  在放射性同位素實(shí)驗(yàn)中,所引用的放射性標(biāo)記化合物的化學(xué)量是極微量的,它對(duì)體內(nèi)原有的相應(yīng)物質(zhì)的重量改變是微不足道的,體內(nèi)生理過(guò)程仍保持正常的平衡狀態(tài),獲得的分析結(jié)果符合生理?xiàng)l件,更能反映客觀存在的事物本質(zhì)。 放射性同位素示蹤法的優(yōu)點(diǎn)如上所述,但也存在一些缺陷,如從事放射性同位素工作的人員要受一定的專(zhuān)門(mén)訓(xùn)練,要具備相應(yīng)的安全防護(hù)措施和條件,在目前個(gè)別元素(如氧、氮等)還沒(méi)有合適的放射性同位素等等。在作示蹤實(shí)驗(yàn)時(shí),還必須注意到示蹤劑的同位素效應(yīng)和放射效應(yīng)問(wèn)題。所謂同位素效應(yīng)是指放射性同位素(或是穩(wěn)定性同位素)與相應(yīng)的普通元素之間存在著化學(xué)性質(zhì)上的微小差異所引起的個(gè)別性質(zhì)上的明顯區(qū)別,對(duì)于輕元素而言,同位素效應(yīng)比較嚴(yán)重。因?yàn)橥凰刂g的質(zhì)量判別是倍增的,如3H質(zhì)量是1H的三倍,2H是1H的兩倍,當(dāng)用氚水(3H2O)作示蹤劑時(shí),它在普通H2O中的含量不能過(guò)大,否則會(huì)使水的物理常數(shù)、對(duì)細(xì)胞膜的滲透及細(xì)胞質(zhì)粘性等都會(huì)發(fā)生改變。但在一般的示蹤實(shí)驗(yàn)中,由同位素效應(yīng)引起的誤差,常在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi),可忽略不計(jì)。放射性同位素釋放的射線利于追蹤測(cè)量,但射線對(duì)生物體的作用達(dá)到一定劑量時(shí),會(huì)改變機(jī)體的生理狀態(tài),這就是放射性同位素的輻射效應(yīng),因此放射性同位素的用量應(yīng)小于安全劑量,嚴(yán)格控制在生物機(jī)體所能允許的范
圍之內(nèi),以免實(shí)驗(yàn)對(duì)象受輻射損傷,而得錯(cuò)誤的結(jié)果。


二、示蹤實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段
正式實(shí)驗(yàn)階段
放射性去污染和放射性廢物處理

  設(shè)計(jì)一個(gè)放射性同位素的示蹤實(shí)驗(yàn)應(yīng)從實(shí)驗(yàn)的目的性,實(shí)驗(yàn)所具備的條件和對(duì)放射性的防護(hù)水平三方面著手考慮。原則上必須從兩個(gè)主要方面來(lái)設(shè)計(jì)放射性示蹤實(shí)驗(yàn):一是必須尋求有效的、可重復(fù)的測(cè)定放射性強(qiáng)度的條件,二是必須選擇一個(gè)合適的比活度λqδ(單位是原子/時(shí)間/分子,dpm/mol或ci/mol)。其中,λ=-dN’dt/N’為該處放射性原子核的衰變常數(shù)。q=N ’/n’,表示n’個(gè)該化學(xué)形式分子為N’個(gè)放射性原子所標(biāo)記。δ=n’/n表示放射性標(biāo)記的分子數(shù)n’與總分子數(shù)(標(biāo)記的加未標(biāo)記的)n之比。采用放射性同位素示蹤技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)所研究課題預(yù)期目的全部或一部分,一般須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段,實(shí)驗(yàn)階段和放射性廢物處理三個(gè)步驟。

(一)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段

1.示蹤劑的選擇
  選定放射性示蹤劑的比活度λqδ的值必須足夠大,以保證實(shí)驗(yàn)所需要的靈敏度,而又要盡可能地小,使得在該實(shí)驗(yàn)條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)短,來(lái)選擇具有合適的衰變方式,輻射類(lèi)型和半衰期,且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種,其中大多數(shù)不常能用作放射性示蹤劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產(chǎn)方法中,生產(chǎn)步驟很可能包含或多或少的化學(xué)處理,因而示蹤實(shí)驗(yàn)人員需要了解某個(gè)核素及其周?chē)哪切┰氐幕瘜W(xué)性質(zhì),因?yàn)樗鼈冇锌赡艹蔀榇朔派湫酝凰氐碾s質(zhì)。
  放射性同位素都衰變(經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)中間狀態(tài))到處于基態(tài)的子體核素,衰變時(shí)伴隨各種形式的能量輻射,如α、β-、β+、γ、X放射等。在選擇示蹤劑時(shí),示蹤實(shí)驗(yàn)人員要仔細(xì)研究衰變綱圖,根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和計(jì)數(shù)條件來(lái)決定那一種輻射,在衰變綱變內(nèi),代表核能級(jí)的兩條水平線之間和距離表示能量差,↑或↓表示能級(jí)同伴隨原子序數(shù)增或減少的能量,↓表示從激發(fā)態(tài)至基態(tài)的同質(zhì)異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素,使τ足夠長(zhǎng),從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正,同時(shí)又要足夠短,能較安全地進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn),并使得放射性廢物容易處理,在實(shí)際工作中,使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)需要持續(xù)的時(shí)間t相適應(yīng),如對(duì)于某個(gè)實(shí)驗(yàn),t/τ=0.04時(shí),應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5%;而t/τ=0.10時(shí),應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6%。t/τ=0.15時(shí),應(yīng)選用其衰變校正為10%。
  在體外示蹤條件,一般選用半衰期較長(zhǎng)而射線強(qiáng)度適中,既利于探測(cè),又易于防護(hù)和保存的放射性示蹤劑。體內(nèi)示蹤條件下,若實(shí)驗(yàn)周期短,應(yīng)選用半衰期短,且能放出一定強(qiáng)度r射線物放射性同位素,若實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),如需要將動(dòng)物活殺后對(duì)組織臟器分別測(cè)定的,則應(yīng)選用半衰期較長(zhǎng)放射性同位素。此外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選用定位的或不定位的標(biāo)記示蹤劑,例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng),14C應(yīng)標(biāo)記在羧基上,只有這種定位標(biāo)記的氨基酸,才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。而有些實(shí)驗(yàn)不要求特定位置標(biāo)記,只須均勻標(biāo)記即可。
  選擇放射性示蹤劑還必須同時(shí)滿足高化學(xué)純度,高放射性核純度的要求。在示蹤劑制備期間、貯存期間以用試驗(yàn)體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶等可能會(huì)產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì),這些雜質(zhì)的存在,使得示蹤實(shí)驗(yàn)中使用的示蹤劑不“純”,而或多或少影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,甚至?xí)䦟?dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。 氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和尿嘧啶核苷(3H-UR)是兩種常用的示蹤劑,前者有效地結(jié)合到DNA中,后者則摻入到RNA中,它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35%輻射分解為3H-胸腺嘧啶,并導(dǎo)致二醇和水合物的形式,在實(shí)驗(yàn)中這雜質(zhì)會(huì)很快摻入細(xì)胞并與大分子(很可能是蛋白質(zhì))結(jié)合,而不是與DNA和RNA相結(jié)合,這些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細(xì)胞都不除去。3H-TdR和3H-UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比+2℃增加3-4倍,但低溫度(-140℃)對(duì)貯存也有利,在允許對(duì)示蹤實(shí)驗(yàn)人員在選擇保存放射性示蹤劑時(shí)會(huì)有所啟發(fā)。

2.放射性同位素測(cè)量方法的選擇
  測(cè)量方法的選擇取決于射線種類(lèi),對(duì)于α射線通常可用硫化鋅晶體、電離室、核乳膠等方法探測(cè);對(duì)能量高的β射線可用云母窗計(jì)數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測(cè)定,對(duì)于能量低的β射線可用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量:對(duì)于γ射線則用G-M計(jì)數(shù)管,碘化鈉(鉈)閃爍晶體探測(cè)。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要采用晶體閃爍計(jì)數(shù)法和液體閃爍計(jì)數(shù)法兩種測(cè)量方式。
  同一臺(tái)探測(cè)儀器對(duì)不同量的示蹤劑具有不同的最佳工作條件,在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段要檢查探測(cè)器是否已調(diào)有所用示蹤同位素的工作條件,否則需要用一定量的示蹤劑作為放射源(或選用該同位素的標(biāo)準(zhǔn)源),把探測(cè)器的最佳工作條件調(diào)整好,并且要保證探測(cè)器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。
  探測(cè)最佳工作條件的選擇方法:一種是測(cè)“坪曲線”,另一種是找最好的品質(zhì)因素。對(duì)于光電倍增管,在理論上不存在“坪”(plateau)。但隨著高壓的增加,在一定范圍內(nèi),脈沖數(shù)變化較小,形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線,通常也稱(chēng)其為坪。測(cè)坪曲線的方法:固定放射源,根據(jù)其射線能量的大小,初選 一個(gè)廣大器增益(放大倍數(shù))和甄別器閾值。不斷地改變高壓(由低到高,均勻增加伏度),每改變一次高壓,都測(cè)定一次本底和放射源的計(jì)數(shù)率,最后作出高壓本底計(jì)數(shù)率和高壓放射源計(jì)數(shù)曲線。用同樣的方法,作另一個(gè)甄別閾值(放大倍數(shù)不變)下的高壓計(jì)數(shù)率曲線,這樣反復(fù)多作幾條曲線。必要時(shí),還可固定甄別閾值,改變放大倍數(shù),求出高壓計(jì)數(shù)率曲線。應(yīng)選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件:甄別閾值和放大增益,作為正式測(cè)定時(shí)間的儀器工作條件,高壓值應(yīng)選擇在該“坪”中點(diǎn)偏向起始段一邊相應(yīng)的高壓值。品質(zhì)因素,又稱(chēng)為優(yōu)值,是指在一定條件下,要達(dá)到合適的統(tǒng)計(jì)數(shù)目所需要的時(shí)間是儀器的計(jì)數(shù)效率E和本底計(jì)數(shù)Nb的函數(shù): 品質(zhì)因素F=E2/Nb它是衡量一臺(tái)計(jì)數(shù)器性能的指標(biāo),儀器的品質(zhì)因素F應(yīng)該越大越好,品質(zhì)因素F越大,表示測(cè)量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性示蹤的標(biāo)準(zhǔn)源存在來(lái)源困難等問(wèn)題的話,可以用相對(duì)品質(zhì)因素f來(lái)代替。 相品質(zhì)因素f=ns/nb 式中ns指某種放射性樣品的計(jì)數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與測(cè)坪曲線一樣,作出幾條高壓-F(或f)的關(guān)系曲線,在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對(duì)應(yīng)的條件:高壓,甄別閾,放大倍數(shù)等,就是該儀器對(duì)被測(cè)同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上,有的在“坪”附近,有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個(gè)能譜峰都計(jì)下來(lái)的示蹤實(shí)驗(yàn)者主張取“坪”所對(duì)應(yīng)的工作條件,而著眼于優(yōu)值者,主張取最佳品質(zhì)因素所對(duì)應(yīng)的工作條件,也有人折衷。如果某儀器本底很低,光電倍增管噪音很低和能譜分辯高,二者應(yīng)該相差不大。同一臺(tái)儀器的最佳工作條件,隨儀器的使用期延長(zhǎng)而有所改變,不同的放射性同位素,其最佳工作條件不同。因此核探測(cè)儀器的最佳工作條件具有專(zhuān)屬性,并且要經(jīng)常通過(guò)選擇其不同時(shí)期的最佳工作條件。更不能不問(wèn)被測(cè)同位素的種類(lèi),而千篇一律地使用同一個(gè)工作條件。
  為了達(dá)到準(zhǔn)確地計(jì)數(shù),可以長(zhǎng)時(shí)間一次計(jì)數(shù),或短時(shí)間多次測(cè)量,兩者達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)誤基本相同,為避免外界因素的影響,在實(shí)際工作中,取短時(shí)間多次測(cè)量較為合理適用。在測(cè)量樣品的放射性時(shí),本底是一個(gè)重要影響因素。本底高,則標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差都增大,尤其在樣品計(jì)數(shù)較低時(shí),本底對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差的影響就愈大,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度,而且為了達(dá)到一定的精度,勢(shì)別要增加樣品的測(cè)量時(shí)間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計(jì)規(guī)律,在實(shí)驗(yàn)中如果樣品數(shù)量少,選擇tN=1.4tb的比例(式中tN為樣品放射性測(cè)量時(shí)間,tb為本底測(cè)量時(shí)間)較為合理;如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品,則延長(zhǎng)本底測(cè)量時(shí)間tb,取tb的時(shí)間均值,而tN則可相對(duì)短,這樣可節(jié)省時(shí)間,有利于縮短實(shí)驗(yàn)周期。對(duì)于示蹤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)說(shuō),樣品中所含放射性強(qiáng)度的要求,是使其放射性計(jì)數(shù)率大于或等于本底計(jì)數(shù)的10-20倍。

3.進(jìn)行非放射性的模擬實(shí)驗(yàn),把實(shí)驗(yàn)全過(guò)程預(yù)演一遍

  同位素示蹤實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確、仔細(xì),稍有疏忽或考慮不周就匆忙進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),既容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,又會(huì)造成示蹤劑和其它實(shí)驗(yàn)用品的浪費(fèi),還會(huì)增加放射性廢物,增加實(shí)驗(yàn)室本底水平,使實(shí)驗(yàn)者接受不必要的輻射劑量,所以模擬實(shí)驗(yàn)不僅可以檢查正式實(shí)驗(yàn)中所用器材,藥品是否合格,又可以操作人員進(jìn)行訓(xùn)練,以保證正式實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。

(二)正式實(shí)驗(yàn)階段

1.選擇放射性同位素的劑量
  同位素必須能經(jīng)得起稀釋?zhuān)蛊渥詈髽悠返姆派湫圆荒艿陀诒镜祝话銇?lái)說(shuō)放射性同位素在生物體內(nèi)不是完全均勻地被稀釋?zhuān)赡茉谀承┢鞴佟⒔M織、細(xì)胞、某些分子中有選擇性地蓄積,蓄積的部分放射性就會(huì)很強(qiáng),在這種情況下,應(yīng)以相關(guān)部位對(duì)示蹤劑的蓄積率來(lái)考慮示蹤劑用量。在細(xì)胞培養(yǎng),切片保溫,酶反應(yīng)等示蹤實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒎磻?yīng)時(shí)間及反應(yīng)體積的不同來(lái)考慮示蹤劑的用量,通常小于一個(gè)微居里或幾個(gè)微居里。 由于放射性同位素存在輻射效應(yīng),應(yīng)該根據(jù)使用的放射性核素的種類(lèi),將用量控制在最大允許劑量之內(nèi)(maximun permissible dose),以免因劑量過(guò)大所造成的輻射效應(yīng),給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)較大的誤差。

2.選擇示蹤劑給入途徑
  整體示蹤實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇易吸收、易操作的給入途徑,一般給予的數(shù)量體積小,要求給予的劑量準(zhǔn)確,防止可能的損失和不必要的污染。體外示蹤實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)步驟的某個(gè)環(huán)節(jié)加入一定劑量的示蹤到反應(yīng)系統(tǒng)中去,力求操作準(zhǔn)確,仔細(xì)。

3.放射性生物樣品的制備
  根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮褪聚檮┑臉?biāo)記放射性同位素的性質(zhì)制備放射性生物樣品,其中放射性同位素的性質(zhì)是生物樣品制備形式的主要依據(jù)。若是釋放r射線的示蹤劑,則樣品制備比較容易,只要定量地取出被測(cè)物放入井型NaI(TL)晶體內(nèi)就能測(cè)定;若是釋放出硬β射線的示蹤劑,須將生物樣品制成厚度較薄的液體,或?qū)⒁后w鋪樣后烘干,也可灰化后鋪樣,放入塑料晶體閃爍儀內(nèi)測(cè)定,或用鐘罩型蓋一革計(jì)數(shù)管探測(cè);若標(biāo)記同位素僅釋放軟β射線,那么樣品應(yīng)制成液體閃爍樣品(詳見(jiàn)放射性測(cè)量”一章),在液體閃爍計(jì)數(shù)器內(nèi)測(cè)量。不論采用何種測(cè)量方法,都應(yīng)該對(duì)樣品作定量采集。對(duì)某些放射性分散的樣品,應(yīng)當(dāng)作適當(dāng)濃集,如測(cè)定組織內(nèi)蛋白質(zhì)的放射性,應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)作提取處理然后制備成相應(yīng)的測(cè)量樣品。有些樣品需采用灰化法,但灰化法對(duì)易揮發(fā)的同位素或易揮發(fā)的組織樣品不合適。

4.放射性樣品的測(cè)量

  測(cè)量方法分為絕對(duì)測(cè)量和相對(duì)測(cè)量。絕對(duì)測(cè)量是對(duì)樣品的實(shí)有放射性強(qiáng)度作測(cè)量,求出樣品中標(biāo)記同位素的實(shí)際衰變率,在作絕對(duì)測(cè)量時(shí),要糾正一些因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響,這些因素包括儀器探頭對(duì)于放射源的相對(duì)立體角、射線被探頭接收后被計(jì)數(shù)的幾率、反散射、 放射源的自吸收影響等等。而相對(duì)測(cè)量只是在某個(gè)固定的探測(cè)儀器上作放射性強(qiáng)度的相對(duì)測(cè)量,不追求它的實(shí)際衰變率。在一般的示蹤實(shí)驗(yàn)中,大多采用相對(duì)測(cè)量的方法,比較樣品間的差異。在相對(duì)測(cè)量時(shí),要注意保持樣品與探測(cè)器之間的幾何位置固定。幾何條件的影響是放射性測(cè)量中最重要的影響因素。當(dāng)兩個(gè)放射性強(qiáng)度相同的樣品在測(cè)量中所置的幾何位置不一,或樣品制備過(guò)程造成的幾何條件差異,其計(jì)數(shù)會(huì)相差很多,尤其當(dāng)樣品與探頭之間距離較近時(shí),兩者計(jì)數(shù)率相差會(huì)很大。但是當(dāng)樣品與探頭之間相距較遠(yuǎn)時(shí),由于樣品與探頭之間形成的相對(duì)立體角較小,所以?xún)烧哂?jì)數(shù)率的差異會(huì)顯著減小。在用紙片法測(cè)量3H標(biāo)記物的放射性強(qiáng)度時(shí),要注意紙片在閃爍瓶中的位置,一批樣品應(yīng)該一致,如果是將濾紙剪成圓狀作支持物,圓片的直徑最好與閃爍瓶底的直徑相等,保證濾紙?jiān)陂W爍瓶?jī)?nèi)的位置固定。減小幾何條件對(duì)放射性測(cè)量的影響可以從三方面入手:⑴選擇探測(cè)窗大的探測(cè)器,如光電倍增管作探頭的探測(cè)器;⑵在樣品制備時(shí),注意盡量將樣品做成點(diǎn)狀源,這樣當(dāng)樣品的放射性強(qiáng)度較弱時(shí),由于距離探測(cè)窗較近而有可能造成的水平位移的影響就可以忽略;⑶無(wú)論樣品距離探測(cè)窗遠(yuǎn)近,樣品都應(yīng)置于探測(cè)窗的垂直軸線上,以減少樣品與探測(cè)窗之間的相對(duì)立體角。

 (三)放射性去污染和放射性廢物處理
  放射性實(shí)驗(yàn),無(wú)論是每次實(shí)驗(yàn)或階段性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現(xiàn),因此,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,要作去污染處理和放射性廢物處理。必要時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行中,就要作除污染和清理放射性廢物的工作。

三、同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用


  放射性同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛,它為揭示體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)理化過(guò)程的秘密,闡明生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)起了極其重要的作用。近幾年來(lái),同位素示蹤技術(shù)在原基礎(chǔ)上又有許多新發(fā)展,如雙標(biāo)記和多標(biāo)記技術(shù),穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù),活化分析,電子顯微鏡技術(shù),同位素技術(shù)與其它新技術(shù)相結(jié)合等。由于這些技術(shù)的發(fā)展,使生物化學(xué)從靜態(tài)進(jìn)入動(dòng)態(tài),從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平,闡明了一系列重大問(wèn)題,如遺傳密碼、細(xì)胞膜受體、RNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄等,使人類(lèi)對(duì)生命基本現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)開(kāi)辟了一條新的途徑。下面僅就同位素示蹤技術(shù)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用的幾個(gè)主要方面作一介紹。

1.物質(zhì)代放謝的研究
  體內(nèi)存在著很多種物質(zhì),究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的,如果在研究中應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化,就可以知道它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系,還能分辯出誰(shuí)是前身物,誰(shuí)是產(chǎn)物 ,分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上,可以進(jìn)一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制。為了研究膽固醇的生物合成及其代謝,采用標(biāo)記前身物的方法,揭示了膽固醇的生成途徑和步驟,實(shí)驗(yàn)證明,凡是能在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴]o酶A的化合物,都可以作為生成膽固醇的原料,從乙酸到膽固醇的全部生物合成過(guò)程,至少包括36步化學(xué)反應(yīng),在鯊烯與膽固醇之間,就有二十個(gè)中間物,膽固醇的生物合成途徑可簡(jiǎn)化為:乙酸→甲基二羥戊酸→膽固醇 又如在研究肝臟膽固醇的來(lái)源時(shí),用放射性同位素標(biāo)記物3H-膽固醇作靜脈注射的示蹤實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,放射性大部分進(jìn)入肝臟,再出現(xiàn)在糞中,且甲狀腺素能加速這個(gè)過(guò)程,從而可說(shuō)明肝臟是處理血漿膽固醇的主要器官,甲狀腺能降低血中膽固醇含量的機(jī)理,在于它對(duì)血漿膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)移過(guò)程的加速作用。

2.物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究
  物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律是生命活動(dòng)中重要的本質(zhì)內(nèi)容,在過(guò)去的物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中,一般都采用用離體酶學(xué)方法,但是離體酶學(xué)方法的研究結(jié)果,不一定能代表整體情況,同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用,使有關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)的周期大大縮短,而且在離體、整體、無(wú)細(xì)胞體系的情況下都可應(yīng)用,操作簡(jiǎn)化,測(cè)定靈敏度提高,不僅能定性,還可作定量分析。 在闡明核糖苷酸向脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)化的研究中,采用雙標(biāo)記法,對(duì)產(chǎn)物作雙標(biāo)記測(cè)量或經(jīng)化學(xué)分離后分別測(cè)量其放射性。如在鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(GMP)的堿基和核糖上分別都標(biāo)記上14C,在離體系統(tǒng)中使之參入脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(dGMP),然后將原標(biāo)記物和產(chǎn)物(被雙標(biāo)記GMP摻入的dGMP)分別進(jìn)行酸水解和層析分離后,測(cè)定它們各自的堿基和戊糖的放射性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的兩部分的放射性比值基本相等,從而證明了產(chǎn)物dGMP的戊糖就原標(biāo)記物GMP的戊糖,而沒(méi)有別的來(lái)源,否則產(chǎn)物dGMP的堿基和核糖的比值一定與原標(biāo)記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明戊糖脫氧是在堿基與戊糖不分記的情況下進(jìn)行的,從而證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉(zhuǎn)化而來(lái)的,并不是核糖核苷酸先分解成核糖與堿基,堿基再重新接上脫氧杭核糖。無(wú)細(xì)胞的示蹤實(shí)驗(yàn)可以分析物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化條件,例如以3H-dTTP為前身物作DNA摻入的示蹤實(shí)驗(yàn),按一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)摻入后,測(cè)定產(chǎn)物DNA的放射性,作為新合成的DNA的檢出指標(biāo)。

3.動(dòng)態(tài)平衡的研究
  闡明生物體內(nèi)物質(zhì)處于不斷更新的動(dòng)態(tài)平衡之中,是放射性同位素示蹤法對(duì)生命科學(xué)的重大貢獻(xiàn)之一,向體內(nèi)引入適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物,在不同時(shí)間測(cè)定物質(zhì)中同位素含量的變化,就能了解該物質(zhì)在體內(nèi)的變動(dòng)情況,定量計(jì)算出體內(nèi)物質(zhì)的代謝率,計(jì)算出物質(zhì)的更新速度和更新時(shí)間等等。機(jī)體內(nèi)的各種物質(zhì)都在有大小不同的代謝庫(kù),代謝庫(kù)的大小可用同位素稀釋法求也。

4.生物樣品中微量物質(zhì)的分析
  在放射性同位素示蹤技術(shù)被應(yīng)用之前,由于制備樣品時(shí)的丟失而造成回收率低以及測(cè)量靈敏度不高等問(wèn)題,使得對(duì)機(jī)體正常功能起很重要作用的微量物質(zhì)不易被測(cè)定。近年來(lái)迅速發(fā)展、應(yīng)用愈來(lái)愈廣泛的放射免疫分析(radioimmunoassay)技術(shù)是一種超微量的分析方法,它可測(cè)定的物質(zhì)300多種,其中激素類(lèi)居多,包括類(lèi)固醇激素,多肽類(lèi)激素,非肽類(lèi)激素,蛋白質(zhì)物質(zhì),環(huán)核苷酸,酶,腫瘤相關(guān)的抗原,抗體以及病原體,微量藥物等其它物質(zhì)。

5.最近鄰序列分析法(Nearest neighbour-sequence analysis method)
  放射性同位素示蹤技術(shù),是分子生物學(xué)研究中的重要手段之一,對(duì)蛋白質(zhì)生物合成的研究,從DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)翻譯均起了很大的作用。最近鄰序列分析法應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)結(jié)合酶切理論和統(tǒng)計(jì)學(xué)理論,研究證實(shí)了DNA分子中堿基排列規(guī)律,在體外作合成DNA的實(shí)驗(yàn):分四批進(jìn)行,每批用一種不同的32P標(biāo)記脫氧核苷三磷酸,32P標(biāo)記在戊糖5'C的位置上,在完全條件下合成后,用特定的酶打開(kāi)5'C-P鍵,使原堿基上通過(guò)戊糖5'C相連的32P移到最鄰近的另一單核苷酸的3'C上 。用最近鄰序列分析法首次提出了DNA復(fù)制與RNA轉(zhuǎn)錄的分子生物學(xué)基礎(chǔ),從而建立了分子雜交技術(shù),例如以噬體T2-DNA為模板制成[32P]RNA,取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中,經(jīng)加熱使DNA雙鏈打開(kāi),并溫育,用密度梯度離心或微孔膜分離出DNA-[32P]RNA復(fù)合體測(cè)其放射性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果只有菌體T2的DNA能與該[32P]RNA
形成放射性復(fù)合體。從而證明了RNA與DNA模板的堿基呈特殊配對(duì)的互補(bǔ)關(guān)系,用分子雜交技術(shù)還證實(shí)了從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。此外,放射性同位素示蹤技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)的貢獻(xiàn)還表現(xiàn)在:⑴對(duì)蛋白質(zhì)合成過(guò)程中三個(gè)連續(xù)階段,即肽鏈的起始、延伸和終止的研究;⑵核酸的分離和純化;⑶核酸末端核苷酸分析,序列測(cè)定;⑷核酸結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系;⑸RNA中的遺傳信息如何通過(guò)核苷酸的排列順序向蛋質(zhì)中氨基酸傳遞的研究等等。為了更好地應(yīng)用放射性同位素示蹤技術(shù),除了有賴(lài)于示蹤劑的高質(zhì)量和核探測(cè)器的高靈敏度外,關(guān)鍵還在于有科學(xué)根據(jù)的設(shè)想和創(chuàng)造性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及各種新技術(shù)的綜合應(yīng)用。

 
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