等電點(diǎn)聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，電聚焦的優(yōu)點(diǎn)是：有很高的分辨率，可將等電點(diǎn)相差0.01-0.02pH單位的蛋白質(zhì)分開；一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響，隨著時間和所走的距離加長，區(qū)帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶越走越窄；由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其電點(diǎn)，很稀的樣品也可進(jìn)行分離；可直接測出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其精確度可達(dá)0.01pH單位。電聚焦技術(shù)的缺點(diǎn)是：一是電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀，二 是樣品中的成分必需停留于其等電點(diǎn)，不適用在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。

　　電聚焦技術(shù)要求有穩(wěn)定的pH梯度，要求極防止對流和防止已分離區(qū)帶再混合的措施，其辦法有三：密度梯度，聚丙烯酰胺凝膠和區(qū)帶對流聚焦，以第一種方法為常用。

一、基本原理

（1）人工pH梯度：在分離蛋白質(zhì)時常用一個直立的性，以蔗糖密度梯度防止對流。當(dāng)兩個不同pH的緩沖液互相擴(kuò)散時，在其混合區(qū)間即形成pH梯度，稱為“人工pH梯度”。因為緩沖液是電解質(zhì)，在電場中的它的離子移動會引起pH梯度的改變，所以不穩(wěn)定。

（2）天然pH梯度：這種梯度是由電流本身所引起并保持的，比較穩(wěn)定，其形成過程是，當(dāng)電解硫酸鈉的稀溶液時，在陽極聚焦硫酸而在陰極聚焦氫氧化鈉。若將一些兩性電解質(zhì)放入槽中，則它們在陽極的酸性介質(zhì)中就會得到質(zhì)子而帶正電，在陰極的堿性介質(zhì)中則失掉質(zhì)子而帶負(fù)電，這樣就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動。設(shè)其中有一個酸性最強(qiáng)的兩性電解質(zhì)（甲），當(dāng)它由陰極逐漸接近陽極的硫酸時，就會失去電荷而停止運(yùn)動，（甲）所在的位置就是它的等電點(diǎn)，另有一個等電點(diǎn)稍高于（甲）的物質(zhì)（乙)，當(dāng)向陽極運(yùn)動靠近（甲）時，它不能超過（甲），因為那里低于它的等電點(diǎn)。于是（乙)將帶正電荷而向陰極移動，它只能排要（甲）的陰極側(cè)。假如有很多兩性電解質(zhì)，它們就會按照等電點(diǎn)由低到高的順序依次排列，形成一個由陽極向陰極逐步升高的平穩(wěn)的pH梯度，此梯度的進(jìn)程取決于兩性電解質(zhì)的pH值，濃度和緩沖性質(zhì)。防止對流的情況下，只要電流穩(wěn)定，這個pH梯度將保持不變。

（3）兩性電解質(zhì)互相分離的條件：上述經(jīng)驗甲乙兩物質(zhì)形成兩個相鄰的不同pH的等電點(diǎn)層，因為在它們中間不能形成純水層，所以它們不是完全分離開的，中間部分互相擴(kuò)散，互相粘連。要使兩物質(zhì)完全分開，中間必須有一個介于其間pH值的物質(zhì)，例如，當(dāng)甲乙兩物質(zhì)的pH值正好一個在7以下，一個在7以上，即可以分開，因為中間形成了純水層（pH=7)，這時水是作為一個兩性電解質(zhì)而存在。

（4）蛋白質(zhì)的電聚焦分離：蛋白質(zhì)及多肽是兩性電解質(zhì)，它們比氨基酸更適于電聚焦，因為它們在等電點(diǎn)附近仍有電荷而能進(jìn)行電遷移，大部分中性氨基酸在接近等電點(diǎn)時就失去電荷而停止運(yùn)動，不能過到真正的等電點(diǎn)。但在沒有第三種居間的兩性電解質(zhì)存在時也不能將兩種蛋白質(zhì)完全分開，必須有很多不同pH值的是電解質(zhì)（載體兩性電解質(zhì)）才能解決這個問題。

二、載體兩性電解質(zhì)

（1）載體兩性電解質(zhì)必需具備的條件：
（i）在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品蛋白質(zhì)或其他兩性物質(zhì)的緩沖能力改變pH梯度的進(jìn)程。
（ii）在等電點(diǎn)必需的足夠高電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，而且要求具備不同pH值的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，使整個體系中的電導(dǎo)均勻，如果有局部電導(dǎo)過小，就會產(chǎn)生極大的電位降，從而其他部分電壓就會太小，以致不能保持梯度，也不能使應(yīng)聚焦的成分進(jìn)行電遷移，達(dá)到聚焦。
（iii）分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過濾法分開。
（iv）化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。
（v）應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。總起來說，當(dāng)一個兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)介于兩個很近的pk值之間時，它在等電點(diǎn)的解離度大，緩沖能力強(qiáng)，而且電導(dǎo)系數(shù)高，這 就是好的載體兩性電解質(zhì)。

（2）理想的載體兩性電解質(zhì)的合成：

　　用具有幾個pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發(fā)生加合反應(yīng)：加合反應(yīng)優(yōu)先加在α、β飽和酸的β碳原子上，調(diào)節(jié)胺和酸的比例可以加上一個或多個羧基，這種合成方法與一般有機(jī)會合成不同，有機(jī)合成一般要求合成的產(chǎn)物愈純愈好，而這里要求合成出的產(chǎn)物愈復(fù)雜愈好，要有多異構(gòu)物和同系物，以保證的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，從而得到平滑的pH梯度。載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)在pH3-10的范圍，分子量在300-1000之間，它們的緩沖能力等于或優(yōu)于組氨酸，電導(dǎo)性能良好，可以使電場強(qiáng)度分布較均勻，它們的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260mμ）很低。

三、密度梯度等電點(diǎn)聚焦

（一）密度梯度

　　密度梯度是用以防止對流保持pH梯度，避免已分離物質(zhì)再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質(zhì)應(yīng)具有以下條件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12克/厘米3，不與樣品蛋白質(zhì)起反應(yīng)，不解離。最常用的是蔗糖（分析純），它對蛋白質(zhì)不僅無害還有保護(hù)作用。重溶液含蔗糖50%（W/V)，這時柱上和柱下最大密度差為0.2克/厘米3，濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解，影響pH梯度及pI值測定，這種情況下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。

（二）pH梯度的選擇

　　在測定未知蛋白時，可先采用pH3-10的載體，經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下范圍時，因缺少中性載體，在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區(qū)帶，純水的電導(dǎo)極低，必須避免此現(xiàn)象。凡使用離開中性的pH范圍的載體時應(yīng)加入相當(dāng)于0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低于3的范圍時，可加有機(jī)酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH離于10時，可補(bǔ)加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導(dǎo)較低，可以與蔗糖密度梯度互相補(bǔ)償，蔗糖濃度高時電導(dǎo)低，所以可把pH6電導(dǎo)低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范圍時，陰極在上，而用pH6以上范圍時，陽極在上方。

（三）蛋白質(zhì)樣品及分離容量

　　電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提純，分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例：如大量提純蛋白質(zhì)，則應(yīng)預(yù)先初步提純。有些物質(zhì)（如核酸）聚焦時會沉淀，應(yīng)預(yù)先除去。蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽，因鹽濃度高電流大，易發(fā)熱，而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸堿，占據(jù)了分離的有效部位。加樣體積不受限制，最高可達(dá)80-85毫升。 　　等電點(diǎn)聚焦的分離容量受下列幾個因素影響：聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質(zhì)，提高密度可以提高分離容量；容量與區(qū)帶高度的平方成正比，降低電壓可使區(qū)帶變寬，提高容量，但分辨率降低，聚焦時間長，用窄的pH梯長范圍可以使區(qū)帶變寬，提高分辨率。用110毫升柱時，每一區(qū)帶蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)２0-25毫克，由于粗蛋白樣品可分為很多區(qū)帶，所以總量可以加至幾百毫克；分離的容量與柱的橫載面成正比，用440毫克柱時，可加粗蛋白質(zhì)5克，每一區(qū)帶可達(dá)一克。