1 多肽飼料的概述
1.1 多肽飼料
我國(guó)蛋白質(zhì)資源不足，每年都要大量進(jìn)口植物蛋白類如大豆及其粕類和動(dòng)物蛋白如魚粉等[1].據(jù)預(yù)計(jì)，在2010年、2020年、2030年我國(guó)將用于生產(chǎn)飼料的糧食約占總量的38%、43%、50%,蛋白飼料缺口仍然將有3000萬噸以上[2].因而極需開發(fā)新的蛋白質(zhì)源，生產(chǎn)出更多的蛋白飼料。
蛋白質(zhì)被動(dòng)物攝取后，經(jīng)腸道多種蛋白水解酶的作用，不是僅以氨基酸的形式吸收的，更多的是以小肽的形式被直接吸收。而且，二肽和三肽的吸收速度比同組成的氨基酸要快。其中，某些小肽不僅具有營(yíng)養(yǎng)功能，而且具有多種生理功能，這是肽理論研究和實(shí)踐應(yīng)用中的重大突破[3].此研制的發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料將是新一代蛋白飼料，其蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后是以具有生理功能的、超吸收的多肽形式存在。
1.2 利用生物技術(shù)增加蛋白質(zhì)和多肽的新資源
為了將大量的棕櫚仁粕（palm kernel cake,簡(jiǎn)稱PKC,下同）利用成為可廣泛應(yīng)用的多肽飼料，是將其粗大纖維變成動(dòng)物可食用的纖維，增加其適口性。其次，通過發(fā)酵增加產(chǎn)品中單細(xì)胞蛋白質(zhì)，開辟了蛋白質(zhì)來源新途徑，不與人類爭(zhēng)資源。第三，利用微生物發(fā)酵生長(zhǎng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解酶將蛋白質(zhì)水解為多肽，最終研制出具有生物活性的多肽飼料產(chǎn)品。利用組合發(fā)酵棕櫚仁粕后干料的蛋白質(zhì)含量為35%～40%.多肽分子量為1000～2000道爾頓的組分。也可以利用植物的根、莖、葉等纖維基質(zhì)和使用受限制的植物粕經(jīng)組合菌發(fā)酵生產(chǎn)出高含量蛋白質(zhì)和多肽的飼料。因而，生物技術(shù)在生產(chǎn)高蛋白質(zhì)飼料中將大有可為，越來越顯示它的強(qiáng)大生命力。
2 棕櫚仁粕多肽飼料
2.1 科學(xué)利用棕櫚仁粕，走綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的經(jīng)濟(jì)模式
棕櫚仁粕中含有粗蛋白15%～20%,蛋氨酸0.312%、賴氨酸0.528%、蘇氨酸0.526%、色氨酸0.12%、精氨酸2.064%、組氨酸0.264%、胱氨酸0.228%、纈氨酸0.84%、苯丙氨酸0.624%;粗脂肪11.13%、粗纖維18.90%、水分9.80%、粗灰分4.68%、鈣0.15%、磷0.41%、總能17.15MJ/kg、無氮浸出物64.8%等一般動(dòng)物生長(zhǎng)所必須的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但棕櫚仁粕只以少量飼喂反芻動(dòng)物，且適口性差。通過微生物發(fā)酵的方法首先降低其粗纖維含量增加適口性；其次將其蛋白含量提高到30%以上；第三，將植物蛋白轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，改善其氨基酸組成，更加符合動(dòng)物蛋白質(zhì)生理模式，從而增加蛋白質(zhì)的消化吸收和利用率，有利于動(dòng)物的生長(zhǎng)需要。
隨著全球棕櫚油產(chǎn)能的增大，其副產(chǎn)物棕櫚仁粕的產(chǎn)量不斷的增加，馬來西亞2006年的棕櫚仁粕產(chǎn)量就已達(dá)220萬噸，其周邊國(guó)家如印尼、泰國(guó)等近幾年大力擴(kuò)大油棕櫚種植面積，棕櫚仁粕產(chǎn)量幾乎與馬來西亞相當(dāng)[4].長(zhǎng)期以來，如何科學(xué)有效處理棕櫚仁粕一直困擾著棕櫚油生產(chǎn)國(guó)和企業(yè)，如今，棕櫚仁粕的產(chǎn)量達(dá)到歷史最高水平，更加劇了棕櫚仁粕對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染。《發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制》項(xiàng)目就致力于棕櫚仁粕的綜合利用，為棕櫚仁粕尋找到了一條有效的、綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的利用途徑。既能減輕或消除由現(xiàn)有處理棕櫚仁粕方法所造成的環(huán)境污染，又能帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
2.2 產(chǎn)品特色
發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚粕多肽飼料是以預(yù)處理后的PKC為唯一碳源，通過高產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌、蛋白質(zhì)含量為50%以上的釀酒酵母[5]和高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌的組合發(fā)酵，使產(chǎn)品中的粗纖維含量降低、纖維長(zhǎng)度變短、蛋白質(zhì)含量增加，不但增加了營(yíng)養(yǎng)，而且提高適口性。尤其是產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)由發(fā)酵中的微生物產(chǎn)生的蛋白酶水解為有活性的多肽。眾所周知，活性多肽是一類易被動(dòng)物機(jī)體吸收和發(fā)揮功能的物質(zhì)，因而是一種高定位的全發(fā)酵的多肽飼料。
《發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制》項(xiàng)目是一項(xiàng)填補(bǔ)世界棕櫚仁粕利用技術(shù)的空白，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和重大的創(chuàng)新性；以價(jià)格低廉的PKC為原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)變成高附加值、高營(yíng)養(yǎng)的多肽飼料，成本低、回報(bào)高、適用廣、具有廣闊的市場(chǎng)前景。特別是蛋白質(zhì)被水解成活性多肽后，動(dòng)物極易吸收、生物利用率高、生物效價(jià)高，具有調(diào)節(jié)免疫、防病抗病等作用。
2.3 產(chǎn)品研制
2.3.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的分離、篩選
2.3.1.1 分離
從國(guó)內(nèi)外采集的土樣、腐爛的樹枝葉、堆積的棕櫚仁粕等70個(gè)樣品中，經(jīng)過5種不同的培養(yǎng)基分離及鑒別染色處理，獲得142株絲狀真菌。
2.3.1.2 初篩
經(jīng)CMC-Na-剛果紅法、PKC-剛果紅法和濾紙條利用法從142株菌種選出19株有效菌，菌株編號(hào)為：3-CMC-②、213-B、623-2、911、1011-1、1042-2、1633、2111、2122-2、2221-P、2616、4341、4632、6612、6922、7022、13001和13005.再經(jīng)過不同配比的培養(yǎng)基篩選出產(chǎn)纖維素酶活性較高的213-B、623-2、912-2、1042-2、1633、2221-P、6612、6922和13005共9株菌進(jìn)入下一輪篩選。
2.3.1.3復(fù)篩 將9株菌經(jīng)以PKC為原料的液體搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)其CMC酶活和FPA酶活，從中選出1042-2、2221-P和13005三株高產(chǎn)纖維素酶菌株。其酶活結(jié)果如表1.
表1 1042-2、2221-P和13005液體產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果
菌 株 濾紙酶活 CMC酶活
（μg/ml.min-1） （μg/ml.min-1）
1042-2 140.3 2660.0
2221-P 58.7 1747.0
13005 57.7 1063.3
2.3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的生物學(xué)特性
形態(tài)學(xué)特征：①13005為我公司所保藏的里氏木霉，菌絲白色、匍匐生長(zhǎng)；產(chǎn)綠色孢子，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子顏色由淺綠色變?yōu)槟G色。②10042-2菌絲白色，氣生菌絲直立生長(zhǎng)、菌絲短而細(xì)；孢子較小，呈棕色，易脫落。③2221-P菌絲白色，氣生菌絲直立生長(zhǎng)、菌絲短而粗；孢子較大，呈黑色，易脫落。
2.3.3 固態(tài)發(fā)酵
2.3.3.1淺盤式發(fā)酵試驗(yàn) 以預(yù)處理后的PKC作為主要基料，并添加部分營(yíng)養(yǎng)成分配制成固體培養(yǎng)基，滅菌后，在無菌環(huán)境中按10%的接種量接入1042-2、2221-P和13005于28℃下培養(yǎng)5～9d.測(cè)定其纖維素酶活、還原糖含量、氨基氮含量、粗蛋白含量等。其間1042-2在培養(yǎng)8d時(shí)其CMC酶活高達(dá)24892U,濾紙酶活高達(dá)1302U,粗蛋白含量達(dá)39.8% .2221-P在培養(yǎng)8d時(shí)，其CMC酶活高達(dá)23410U,濾紙酶活達(dá)1286U,粗蛋白含量高達(dá)40.09% .這組數(shù)據(jù)說明在利用PKC作為培養(yǎng)基發(fā)酵，其纖維素酶酶活和粗蛋白含量都達(dá)目前的最高水平。
2.3.3.2 組合菌種發(fā)酵試驗(yàn) 為了達(dá)到降低木質(zhì)纖維含量，提高蛋白質(zhì)含量，并將蛋白質(zhì)降解為多肽，采用組合菌種發(fā)酵工藝。接入霉菌目的在于降解PKC中的木質(zhì)纖維含量；接入酵母目的是讓其將培養(yǎng)基中的氮源的轉(zhuǎn)化為自身的菌體蛋白，從而增加物料的蛋白質(zhì)含量。接入芽孢桿菌目的是產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)水解酶，將基料中的蛋白質(zhì)盡量的分解為小分子多肽，增加產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)性、功能性和適口性。目前研究表明，PKC物料的木質(zhì)纖維含量降低30%以上，粗蛋白含量平均能達(dá)到35%以上，其中多肽含量已經(jīng)超過80%,目前正在進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，以便得到各項(xiàng)指標(biāo)更優(yōu)的產(chǎn)品。
2.3.4 制劑安全性試驗(yàn) 為了確保發(fā)酵制劑的安全性進(jìn)行了小鼠急性毒理試驗(yàn)。
昆明種小白鼠20只，雌雄各半，體重20～22g隨機(jī)分成4組，禁食不禁水12h .按8g/kg.dw的量以食用油作為溶劑配制成適當(dāng)體積的制劑液，一日內(nèi)完成灌胃，連續(xù)觀察14d,記錄受試小鼠期間的活動(dòng)、攝食量、體重、糞便、死亡等情況，未死亡小鼠2周后用頸椎脫臼法處死進(jìn)行尸檢。
整個(gè)觀察期間沒有小鼠死亡，20只小鼠活動(dòng)、精神狀態(tài)、攝食、糞便等正常，兩周后增重均超過10%,最高增重達(dá)24% ,可以認(rèn)為本發(fā)酵制劑安全無毒。
3 小結(jié)
3.1棕櫚仁粕的綜合利用狀況
棕櫚仁粕歷來是棕櫚油生產(chǎn)企業(yè)的重大負(fù)擔(dān)，也是馬來西亞政府極需解決的生態(tài)環(huán)境的重點(diǎn)問題之一。因?yàn)樽貦叭势芍休^高的木質(zhì)纖維含量和適口性較差等，使得其只有極少部分的棕櫚仁粕作為反芻動(dòng)物的飼料添加劑使用。絕大部分都是燒毀或讓其腐爛作為肥料，這樣不但嚴(yán)重浪費(fèi)資源，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。為此，相關(guān)企事業(yè)科研單位合作，展開了《發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制》項(xiàng)目研究，并取得可喜的成果。2009年3月24日，《發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制》項(xiàng)目進(jìn)行了中期評(píng)審，與會(huì)專家給予了高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為該項(xiàng)目具有獨(dú)立自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和創(chuàng)新性，現(xiàn)階段取得的技術(shù)成果達(dá)到了國(guó)內(nèi)外先進(jìn)水平。
3.2 發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的可行性
棕櫚仁粕含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素約70%,而且多為粗纖維、大纖維，要將其變成可利用的碳水化合物，首先要將他們分解，為此，采用篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株（1042-2、2221-P兩株）發(fā)酵PKC,使其還原糖增加，分析結(jié)果表明纖維素變短、變薄、變小，在不增加外源糖的情況下，釀酒酵母、枯草芽孢桿菌能生長(zhǎng)良好，使發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量增加30%以上，由于絲狀真菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的多種酶系能使蛋白質(zhì)酶解為多肽（MW5000道爾頓以下）,而使產(chǎn)品成為多肽產(chǎn)品。
3.3 棕櫚仁粕多肽飼料的市場(chǎng)前景
3.3.1 棕櫚仁粕多肽飼料的經(jīng)濟(jì)分析 根據(jù)研究預(yù)算，每噸棕櫚仁粕多肽飼料的生產(chǎn)成本為2300元/t,目前，我國(guó)飼料中蛋白質(zhì)含量定價(jià)為8.00～9.00元/kg蛋白質(zhì)。如果以蛋白質(zhì)含量30～40%計(jì)，棕櫚仁粕多肽飼料定價(jià)為3200～3600元/t飼料。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)市場(chǎng)上的微生物發(fā)酵（包括微生物酶處理）的生物飼料價(jià)格范圍為3000～6000元/t.因而，我們生產(chǎn)的棕櫚仁粕多肽飼料的價(jià)格很有提升空間。
3.3.2 市場(chǎng)前景
《發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制》是廢物利用、變廢為寶的社會(huì)公益項(xiàng)目，其技術(shù)又填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外的空白，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)；產(chǎn)品的市場(chǎng)需求巨大，屬于賣方市場(chǎng)，在市場(chǎng)上具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力。隨著生活水平的不斷提高，畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外蛋白飼料的缺口越來越大；作為多肽飼料的產(chǎn)品相比于植物蛋白飼料具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更具功能性。綜觀分析可以預(yù)料，發(fā)酵生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料具有豐厚的經(jīng)濟(jì)效益和重大的生態(tài)環(huán)境、社會(huì)效益。
