也稱脫氮作用。反硝化細菌在缺氧條件下，還原硝酸鹽，釋放出分子態氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的過程。微生物和植物吸收利用硝酸鹽有兩種完全不同的用途，一是利用其中的氮作為氮源，稱為同化性硝酸還原作用：NO3-→NH4 →有機態氮。許多細菌、放線菌和霉菌能利用硝酸鹽做為氮素營養。另一用途是利用NO2-和NO3-為呼吸作用的最終電子受體，把硝酸還原成氮（N2），稱為反硝化作用或脫氮作用：NO3-→NO2-→N2↑。能進行反硝化作用的只有少數細菌，這個生理群稱為反硝化菌。大部分反硝化細菌是異養菌，例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等，它們以有機物為氮源和能源，進行無氧呼吸，其生化過程可用下式表示：
C6H12O6 12NO3-→6H2O 6CO2 12NO2- 能量
CH3COOH 8NO3-→6H2O 10CO2 4N2 8OH- 能量
少數反硝化細菌為自養菌，如脫氮硫桿菌，它們氧化硫或硝酸鹽獲得能量，同化二氧化碳，以硝酸鹽為呼吸作用的最終電子受體。可進行以下反應：
5S 6KNO3 2H2O→3N2 K2SO4 4KHSO4
反硝化作用使硝酸鹽還原成氮氣，從而降低了土壤中氮素營養的含量，對農業生產不利。農業上常進行中耕松土，以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循環中不可缺少的環節，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-減少，消除因硝酸積累對生物的毒害作用。