密度梯度是用以防止對流保持pH梯度，避免已分離物質(zhì)再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質(zhì)應(yīng)具有以下條件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12克/厘米3，不與樣品蛋白質(zhì)起反應(yīng)，不解離。最常用的是蔗糖（分析純），它對蛋白質(zhì)不僅無害還有保護作用。重溶液含蔗糖50%（W/V)，這時柱上和柱下最大密度差為0.2克/厘米3，濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解，影響pH梯度及pI值測定，這種情況下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。
　　在測定未知蛋白時，可先采用pH3-10的載體，經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下范圍時，因缺少中性載體，在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區(qū)帶，純水的電導(dǎo)極低，必須避免此現(xiàn)象。凡使用離開中性的pH范圍的載體時應(yīng)加入相當(dāng)于0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低于3的范圍時，可加有機酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH離于10時，可補加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導(dǎo)較低，可以與蔗糖密度梯度互相補償，蔗糖濃度高時電導(dǎo)低，所以可把pH6電導(dǎo)低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范圍時，陰極在上，而用pH6以上范圍時，陽極在上方。
　　電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提純，分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例：如大量提純蛋白質(zhì)，則應(yīng)預(yù)先初步提純。有些物質(zhì)（如核酸）聚焦時會沉淀，應(yīng)預(yù)先除去。蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽，因鹽濃度高電流大，易發(fā)熱，而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸堿，占據(jù)了分離的有效部位。加樣體積不受限制，最高可達80-85毫升。 　　等電點聚焦的分離容量受下列幾個因素影響：聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質(zhì)，提高密度可以提高分離容量；容量與區(qū)帶高度的平方成正比，降低電壓可使區(qū)帶變寬，提高容量，但分辨率降低，聚焦時間長，用窄的pH梯長范圍可以使區(qū)帶變寬，提高分辨率。用110毫升柱時，每一區(qū)帶蛋白質(zhì)含量最高可達２0-25毫克，由于粗蛋白樣品可分為很多區(qū)帶，所以總量可以加至幾百毫克；分離的容量與柱的橫載面成正比，用440毫克柱時，可加粗蛋白質(zhì)5克，每一區(qū)帶可達一克。