基因突變的研已成為當今生命科學研究的熱點之一，檢測方法也隨之迅速發展。人類細胞癌基因的突變類型已如上所述，對于基因突變的檢測，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測的突變，只能應用復雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術是突變研究中的最重大進展，使基因突變檢測技術有了長足的發展，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術都是建立于PCR的基礎之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現，目前已達二十余種，自動化程度也愈來愈高，分析時間大大縮短，分析結果的準確性也有很大很提高。其中包括單鏈構象多態性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術及經典突變檢測方法，可根據檢測目的和實驗室條件選擇時參考。

PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個堿基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴于其堿基組成，即使一個堿基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測小于200bp的PCR產物時，突變檢出率可達70％-95％，片段大于400bp時，檢出率僅為50％左右，該法可能會存在1％的假陽性率。應用PCR-SSCP法應注意電泳的最佳條件，一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響，同時該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。Sarkar等認為對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應用PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測第5-8外顯子即可發現85％以上的p53基因突變。由于該法簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。

異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結合使用，可使突變檢出率提高到近100％。

突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產物的富集。

變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產物，如果突變發生在最先解鏈的DNA區域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基于當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程
而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測發生于高熔點區的突變。在DGGE的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選。

化學切割錯配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM為在Maxam-Gilbert測序法的基礎上發展的一項檢測突變的技術，其檢測突變的準確性可與DNA測序相仿。其基本原理為將待測含DNA片段與相應的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化餓切割，經變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。該法檢出率很高，也是檢片段最長的方法，已有報功檢測了1.7kb片段，如果同時對正、反義鏈進行分析，檢出率可達100％。應用熒光檢測系統可增強敏感度，可檢測到10個細胞中的1個突變細胞。該法中的化學試劑有毒，又發展了碳二亞胺檢測法（catodiimide,CDI）,CDI為無毒物質，也可檢測大片段DNA的點突變。

等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎對已知突變的檢測技術。以PCR和ASO相結合，設計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經PCR拉增的樣品DNA雜交。可以用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現陽性雜交帶，則表運河樣品中存在與該ASO探針相應的點突變，ASO需嚴格控制雜交條件和設置標準對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。

DNA芯片技術（DNA chip）DNA芯片技術是90年代后發展的一項DNA分析新技術，它集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標記探針和DNA合成等先進技術。可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標記的正常DNA和突變DNA發別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產生的熒光信號，即可確定是否存在突變，該方法快速簡單、片動化程度高，具有很大的發展潛力，將在基因突變檢測中心發揮非常重要的作用。

連接酶鏈反應（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴增技術比較，其最大特點為可準確區分基因序列中單個基因突變，由Landegree于1988年首次應用于鐮刀獎細胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎，應用兩對互補的引物，雙鏈DNA經加熱變性后，兩對引物分別與模板復性，若完全互補，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一次的連接產物又作為下一次循環反應的模板，如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴增。LCR產物檢測最初是通過這32p標記上游引物3`未端，經變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測敏感性達到200個靶分子。也可設計1個橫跨兩引物的檢測探針，用它與LCR產物進行雜交檢測。近年有應用熒光素、地高辛等非核素標記方法。Batt在1994年發展了一種更為簡的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測單個堿基突變的能力，因此被應用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結合用以提高其敏感性。

等位基因特異性擴增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技術應用的發展，也稱擴增阻礙突變系統（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計兩個5`端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR，吸有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。如果錯配位于引物的3`端則導致PCR不能延伸，則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應條件的優化和可能發生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸，特別是當錯配堿基為G：T時，這時可通過調整實驗條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引物3`端的第二個堿基引入一個錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸。

RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產物可通過變性凝膠電泳分離。當RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當錯配堿基為嘧啶時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈，突變檢出率只有30％，如同時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復雜性，但可用于1-2kb的大片段進行檢測，并能確定突變位點。于這些優越性，它仍被作為一種經典方法用于對未知突變進行分析。

染色體原位雜交（In situ hybridization of chromosome）染色體發現距今已有150多年的歷史，染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細胞遺傳學研究，隨著染色體分技術和分子生物學技術的發展。染色體研究范圍也不斷擴大，特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細胞的染色體變化是一非常普遍的現象，可分為原發和繼發兩類。在腫瘤形成的生物學基礎方面，原發性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關，腫瘤細胞中可以發現各種形式的染色體畸變，如缺失、重復、易位、重排、單體斷裂及核內復制等；繼發性變化主要是腫瘤細胞核型的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測方法進展很快，檢測的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。

熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）創建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應用核素標記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應用核素標記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百
堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH具有探針穩定、操作安全，可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優點。FISH的靈敏感與探針標記方法和檢測儀器性能有關，探針標記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探針一般采用隨機引物法或切口翻譯法，如將PCR技術引入FISH探針標記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強信噪比，有利于檢測微弱信號，如應用TSA系統（tyramide signal amplification）能將雜交信號再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應用強變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質中分離出來，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經引處理后，分辨率可達1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進行顯微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一個特點是可以聯合慶用地高辛、生物素等多種標記系統， 在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技術已被廣泛應用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預后和治療監控等方面都有重要意義。

Klch等于1989年發明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色體特異α衛星DNA標記。其基本原理是用非標記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當引物延伸時，摻入標記的核革酸可直接或間接地檢量標記位點。PRINS技術的優點是不需克隆基因作探針，且由于雜交反應在前，標記在后，故非特異懷背景低。缺點是信號弱，靈敏度低，為克服這一制瞇，Terkelsen等建立了重復引物原位標記技術（repeated PRINS）,重復進行PRINS反應，使信號號強度明顯提高。基于FISH的原理，發展了多色原位經物標記（multicolor PRINS）,可測定二個以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特異性比FISH還高。

DNA序列分析（DNA sequencing） 應用各種突變檢測技術檢測到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達到100％。現在的測序方法已與經典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動化程度大為提高，操作更簡便，測序時間也大大縮短。隨著PCR技術與測序聯合使用，不需經過M13亞克隆步驟，故稱為直接測序法（direct sequencing,DS）。DS法測序的模板主主要來源于PCR，應用不對稱PCR（asymmetric PCR）和基因組擴增轉錄同步測序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產物大大增加。近年來，PCR循環測序法的建立，使模板擴增與同步進行，引物用四種不同前顏色的熒光標記，使每個樣品的四個測序反應可在一個反應管和一個泳道內進行，大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自動測序儀已發展到96泳道，并仍在不斷改進。這些高度自動化的測序方法是經較理想的基因突變分析技術，但其昂貴的費用其使用范圍，所以對一些小樣本或為了某些特定目的的樣本分析，仍進行經典的手工測序。

突變基因的檢測方法多種多樣，特別是PCR技術誕生后，許多檢測技術都是在PCR基礎上衍生的。由于PCR擴增南非要的模板量少，使對腫瘤的突變分析可以精確到單細胞，如霍奇金病的R-S細胞的單細胞基因突變分析。另外，應用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測的靶點，其優點是可克服腫瘤組只中間質或癌周組織的混雜，提高準確性。除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測，如對未知突變基因進行分析的酶促切割錯配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長度多態性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯配接合蛋白質截短測試法（protein truncation test,PTT）等。對已知突變基因進行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。