由于各家公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀提供的各種實(shí)驗(yàn)方案不太一致，所以優(yōu)化的策略也不盡相同，然而在各種方案中，前文所述的那些影響實(shí)時PCR 反應(yīng)的因素卻總是相通的。只要能較好地控制實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，要想獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定都是困難的。下面本文將就影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一些基本參數(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟談一談關(guān)于實(shí)時定量PCR的優(yōu)化。
1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：
1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應(yīng)中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關(guān)重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應(yīng)慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為4－8mM。
1.2 模板的濃度：如果研究者是進(jìn)行首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，使Cp位于15－30個循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I測定DNA時的條件優(yōu)化：
2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對其的要求是2－4 mM。
2.2模板的濃度：初次實(shí)驗(yàn)要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。基因組DNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在10^6拷貝數(shù)左右選擇。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進(jìn)行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達(dá)到好的效果，反會使反應(yīng)的敏感度降低，所以，研究者若要進(jìn)行實(shí)時定量PCR研究，最好選用純化的模板。
2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.3－1.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。
2.6 退火溫度：首次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，這個經(jīng)驗(yàn)值往往會同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。
3. 用SYBR Green I進(jìn)行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化：
3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。
3.2模板的濃度：RT－PCR實(shí)驗(yàn)既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應(yīng)在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進(jìn)行測定。
3.3對照設(shè)置：每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對照，陽性對照和污染對照。
4. 雜交探針測定DNA
4.1 MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎(chǔ)上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。
4.2雜交探針的濃度：初次實(shí)驗(yàn)每個探針用0.2uM，如果信號強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3對照設(shè)置：每一引物都要設(shè)陰性對照，每一探針都要設(shè)陰性對照。每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)陽性對照。
4.4 其它的條件同SYBR Green I。
5 用雜交探針實(shí)時定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的濃度：在4－8mM之間進(jìn)行選擇。
5.2雜交探針的濃度：初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴(kuò)增須進(jìn)行一系列知釋度的實(shí)驗(yàn)，在條件有困難的條件下，至少要進(jìn)行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。
5.4 對照設(shè)置：每個引物都要設(shè)無模板對照，陽性對照以及污染對照。
6.關(guān)于雜交探針的評價(jià)：在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競爭反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端完全磷酸化。
目前的實(shí)時定量PCR技術(shù)進(jìn)展迅速，本文是結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的工作經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)資料寫成的，文中提到的一系列方案、實(shí)驗(yàn)材料和儀器設(shè)備都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進(jìn)行何種研究，都應(yīng)根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運(yùn)用實(shí)時定量PCR進(jìn)行研究的人員參考
1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：
1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應(yīng)中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關(guān)重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應(yīng)慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為4－8mM。
1.2 模板的濃度：如果研究者是進(jìn)行首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，使Cp位于15－30個循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I測定DNA時的條件優(yōu)化：
2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對其的要求是2－4 mM。
2.2模板的濃度：初次實(shí)驗(yàn)要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。基因組DNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在10^6拷貝數(shù)左右選擇。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進(jìn)行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達(dá)到好的效果，反會使反應(yīng)的敏感度降低，所以，研究者若要進(jìn)行實(shí)時定量PCR研究，最好選用純化的模板。
2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.3－1.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。
2.6 退火溫度：首次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，這個經(jīng)驗(yàn)值往往會同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。
3. 用SYBR Green I進(jìn)行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化：
3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。
3.2模板的濃度：RT－PCR實(shí)驗(yàn)既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應(yīng)在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進(jìn)行測定。
3.3對照設(shè)置：每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對照，陽性對照和污染對照。
4. 雜交探針測定DNA
4.1 MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎(chǔ)上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。
4.2雜交探針的濃度：初次實(shí)驗(yàn)每個探針用0.2uM，如果信號強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3對照設(shè)置：每一引物都要設(shè)陰性對照，每一探針都要設(shè)陰性對照。每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)陽性對照。
4.4 其它的條件同SYBR Green I。
5 用雜交探針實(shí)時定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的濃度：在4－8mM之間進(jìn)行選擇。
5.2雜交探針的濃度：初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴(kuò)增須進(jìn)行一系列知釋度的實(shí)驗(yàn)，在條件有困難的條件下，至少要進(jìn)行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。
5.4 對照設(shè)置：每個引物都要設(shè)無模板對照，陽性對照以及污染對照。
6.關(guān)于雜交探針的評價(jià)：在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競爭反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端完全磷酸化。
目前的實(shí)時定量PCR技術(shù)進(jìn)展迅速，本文是結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的工作經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)資料寫成的，文中提到的一系列方案、實(shí)驗(yàn)材料和儀器設(shè)備都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進(jìn)行何種研究，都應(yīng)根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運(yùn)用實(shí)時定量PCR進(jìn)行研究的人員參考
