在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomic library）,另一種是cDNA庫。
載體 所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。
細(xì)菌質(zhì)粒 是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對細(xì)菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。
噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。
黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。
表達(dá)型載體 將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達(dá)型載體。
基因庫的建造
含有某種生物體全部基歷的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標(biāo)記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴(kuò)增，可用于進(jìn) 一步的研。其主步驟包括：（1）構(gòu)建基因庫迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。
cDNA庫的建造
是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫包括某特定細(xì)胞的全部cDNA克隆的文庫，不含內(nèi)含子。
特異基因的篩選
常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測法，檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進(jìn)行特異基因的篩選。
核酸序列測定
DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，最終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世。化學(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素，然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，可推算出模板DNA分子的序列。
化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用，合成的引物容易獲得，測序技術(shù)不斷改進(jìn)，故此法已被廣泛應(yīng)用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序，然后反推RNA序列
