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基因運載系統(tǒng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞,需要應用某一基因運載系統(tǒng),目前將這一系統(tǒng)概括為兩大類:非病毒辣方法和病毒方法。

1.基因轉移的非病毒方法

直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉,以引起鄰近的細胞攝入DNA燕進行表達,在肌細胞中,基因表達可持續(xù)數(shù)月。

磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合,形成磷酸鈣微沉淀 ,附著于細胞膜并經過細胞內吞作用耐是入細胞質。該方法的轉化效率通常很低。

脂質體染法 指質體能在體內或體外提供運載外源性遺傳物質進入細胞的載體。脂質體介導的基因轉移的最大優(yōu)勢在于能在活體內應用。

受體介導的基因轉移 依靠受體介導的細胞內吞途徑以轉移外源基因。受體介導的基因轉移方法是在質粒DNA和某種特異的多肽(配體)之間形成復合體,而這種多肽能為細胞表面的肥體所識別。如若將DNA在體內運送至肝內,可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結合的去唾液酸糖蛋白質偶聯(lián),以便通過細胞內吞過程而被攝入,這種DNA大部分被肝臟所攝取。應用該方法轉移的外源基因在活體內的表達持續(xù)時間較短,在評估實際應用前影上還在一些問題。
顯微注射法 在顯微鏡下,將DNA經同細胞玻璃針地接注入細胞,該法適合于各種培養(yǎng)生長的細胞,但需要一定的設備和操作用支巧。

電穿孔法 利用脈沖場將DNA導入培養(yǎng)細胞。

微粒子轟擊法(基因槍)近幾年發(fā)展較快的轉移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導入培胞或活的哺乳動物組織內。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA,將這些微彈加強速到很的速度轟擊細胞。實驗結果表明,用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細胞中表達。

胚胎干細胞法 胚胎干細胞是從受精卵開始分裂至4個國胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細胞,能在體外培養(yǎng),可作為正面細胞,制備轉基因動物,以研究基因定向整合或基因剔險及基因及能。

精子載體法 最近發(fā)現(xiàn)用精子和NDA-劑孵育,可捕獲得DNA。通過受精過程,將外源性基因導入受精卵,可捕獲得物物,大大間化了轉基因動物的制備過程。

2.基因轉移的病毒的方法

病毒作為基因轉移的是基因遞送有有并工具,病毒載體的優(yōu)點有:(1)在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分;(2)在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調節(jié)信號的控制下以進行研究;(3)能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ,并能進分離;(4)轉移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp。目前常用的病毒載體有下列幾種。

逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒辣為RNA病毒,它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上,病毒進入細胞通過逆轉錄作用,病毒RNA即轉變?yōu)殡p鏈DNA分子,DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中,這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復序列(LTR),LTR內側還有為復制所必需的其他順序,包括包裝信號。目前常用的逆轉病毒載體有CMV和SV。

DNA病毒載體 主要有腺病毒相關病毒載體,腺端正毒載體,皰疹病毒載體。對DNA病毒載體的研究是當前基因基因治療研究中的重點領域。
常用的基因轉染技術

將外源基因導入靶細胞需要一定的載體和導入方法,基因轉技術則是將純化的含有靶基因的質粒DNA送入細胞內,并在細胞內表達。轉染方法有多種,根據不同的細胞,貼壁或懸浮細所可選用不同的方法,其目的是要達到設置轉染效率,影響轉染產率的因素有多種,包括轉染方法、操作技術、質粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態(tài)等,下面重點介紹向幾種常用的轉染技術:

靶細胞的準備 被用于作靶基因轉染的細胞,其生長狀態(tài)如何,將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞,一般要求在轉染前一日,必需應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜,轉染當日,在轉染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細胞,也需在轉染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。

靶基因質粒DNA的準備 用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其了化學物質的污染,OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準,目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。

具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后,一般在轉染后48小時,靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的,48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩(wěn)定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。

 

 
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