一、酵母DNA微量制備（40ml）

1．在125ml三角瓶中用40ml YPD培養(yǎng)液在30℃條件下培養(yǎng)細胞達最大生長量（過夜）。
2．將上述培養(yǎng)物移入螺蓋離心管，用醫(yī)用離心機或Sorvall SS－34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。
3．將細胞懸浮在3ml的0.9mol/L山梨醇－0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中。
4．加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T，置37℃條件保溫1小時。
5．用醫(yī)用離心機或Sorvall SS－34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。
6．將細胞重新懸浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸鈉溶液中。
7．加0.5ml的10％十二烷基硫酸鈉（SDS），混勻。
8．置65℃保溫30分鐘。
9．加1.5ml的5mol/L醋酸鉀溶液，在冰浴上放置1小時。
10．用Sorvall SS－34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心10分鐘。
11．將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的塑料離心管中，室溫下加入兩倍體積的95％乙醇，混勻，以5000～6000r/min離心15分鐘。
12．棄上清液，將沉淀物干燥，然后懸浮在3ml TE緩沖液（pH7.4）中，此操作可能需要幾個小時。
13．用Sorvall SS－34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新試管，棄沉淀物。
14．加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液，在37℃下保溫30分鐘。
15．加入一倍體積的100％異丙醇，輕輕混勻，取出呈松散纖維狀的沉淀物，無需離心，讓其自然干燥。
16．將沉淀物懸浮在0.5ml TE緩沖液（pH7.4）中，置4℃保存。酵母DNA的最終濃度約為200μg/ml。如果最后的溶液混濁不清，用異丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS－34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘。

二、酵母DNA微量制備（5ml）

1．按酵母于5ml YPD中，置30℃培養(yǎng)過夜。
2．用醫(yī)用離心機以2000r/min離心5分鐘沉淀細胞，棄上清液。
3．將細胞懸浮在0.5ml的1mol/L山梨醇－0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)緩沖液中，轉(zhuǎn)動一支1.5ml離心管中。
4．加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保溫1小時。
5．離心1小時。
6．棄上清液，把細胞懸浮在.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液。
7．加0.05ml的10％ SDS，混勻。
8．置65℃保溫混合物30分鐘。
9．加0.2ml的5mol/L醋酸鉀，把離心管在冰浴中放置1小時。
10．離心5分鐘。
11．將上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈微型離心管，室溫下加入等體積的無水異丙醇，混勻，放置5分鐘。短暫離心（10秒鐘）棄上清液，讓沉淀自然干燥。
12．用0.3ml TE緩沖液（pH7.4）重新懸浮沉淀。
13．加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保溫30分鐘。
14．加0.03ml的3mol/L醋酸鈉，混勻，用0.2ml的無水異丙醇沉淀，再短暫離心收集DNA。
15．棄上清液，自然干燥，用0.1～0.3ml TE緩沖液（pH7.4）重新懸浮DNA。
16．在使用限制性內(nèi)切酶酶解DNA之前，有必要將最終濃度溶液離心較長時間（15分鐘）以便除去可能抑制酶解的不溶性物質(zhì)。

三、10分鐘制備酵母DNA方法

大腸桿菌或酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的制備

1．在質(zhì)粒DNA選擇性培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)少量培養(yǎng)物過夜。
2．將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一支1.5ml的微型離心管，離心5秒，收集細胞。
3．小心傾去上清液，輕彈離心管，使沉淀重新懸浮于殘余培養(yǎng)液中。
4．加入0.2ml的2％ Triton X－100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8)，1mmol/L Na2EDTA；加入0.2ml的苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）；加入0.3g酸洗過的玻珠。
5．振蕩2分鐘。
6．離心5分鐘。
7．用1～5μl含DNA的水相轉(zhuǎn)化0.2ml的大腸桿菌受體菌，用15μl水相轉(zhuǎn)化酵母菌。

用于Southern分析的基因組DNA分離

1．用YPD培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)10ml酵母至最大生長量。
2．用醫(yī)用離心機離心2分鐘，棄上清液，收集細胞，用0.5ml蒸餾水重新懸浮，將細胞轉(zhuǎn)入1.5ml微型離心管中，離心5秒收集細胞。
3．重復(fù)第二步。
4．重復(fù)第二步。
5．加0.2ml TE緩沖液（pH8），振蕩3～4分鐘。
6．離心5分鐘，將水相移至潔凈試管，加1ml的無水乙醇，上下倒置，混合均勻。
7．離心2分鐘，棄上清液，懸浮在0.4ml TE緩沖液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液，置37℃保溫5分鐘，加入10μl 4mol/L醋酸銨和1ml的無水乙醇，上下倒置，混勻。
8．離心2分鐘，棄上清液，自然干燥后，用50μl的TE緩沖液懸浮，每份樣品用10μl進行Southern印跡分析，每份用量約2～4μg DNA。

四、酵母基因組DNA：玻珠制備法

1．用5ml培養(yǎng)基在30℃下，搖床培養(yǎng)過夜。
2．轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至13mm×100mm的玻璃離心管中，用臺式離心機以1500r/min離心5分鐘，收集細胞。
3．用3ml無菌水洗細胞，同上離心。
4．用500μl裂解緩沖液再次懸浮。
5．加入干凈玻珠（約1.5ml Eppendorf離心管的2/3體積）和25μl的5mol/L NaCl。
6．以最高速振蕩1分鐘。
7．用2000r/min離心2分鐘。
8．用P-1000移液器轉(zhuǎn)移上清液至一支1.5ml的離心管。
9．加入500μl苯酚，振蕩，離心1分鐘。用P-1000移液器吸取水相，轉(zhuǎn)移至潔凈離心管，加入500μl SEVAG（氯仿：已戊醇，24：1），同上振蕩，離心，抽提。
10．加入1ml的95％的冷凍乙醇，在-20℃下沉淀1小時。
11．以最高轉(zhuǎn)速離心沉淀DNA，棄上清液，用70％乙醇清洗，最后懸浮在250μl TE緩沖液中。
12．加25μl的EDTA-Sark和5μl的蛋白酶K（10mg/ml），置37℃保溫30分鐘。
13．加250μl的5mol/L醋酸銨，重復(fù)9、10步驟。
14．收集DNA，用70％乙醇洗，懸浮于100μl的TE緩沖液。