等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位,因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。
⒈IEF的基本原理 在IEF的電泳中,具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極,pH值逐漸增大。如前所述,蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征,這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動,直至某一pH位點時失去電荷而停止移動,此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(pl)。同理,位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動,直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中,等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度,將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中,在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后,各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上,形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。
⒉pH梯度的組成 pH梯度的組成方式有二種,一種是人工pH梯度,由于其不穩(wěn)定,重復(fù)性差,現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物,在正極端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在負(fù)極端引入堿液,如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值,即各段介質(zhì)中的pH相等,用pH0表示。電泳開始后,混合物中pH最低的分子,帶負(fù)電荷最多,pI1為其等電點,向正極移動速度最快,當(dāng)移動到正極附近的酸液界面時,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,這一分子不再向前移動而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力,使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì),其等電點為pI2,也移向正極,由于pI2>pI1,因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后,這樣,經(jīng)過一定時間后,具有不同等電點的兩性電解質(zhì)按各自的等電點依次排列,形成了從正極到負(fù)極等電點遞增,由低到高的線性pH梯度。
⒊兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì) 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo),前者保證pH梯度的穩(wěn)定,后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小,易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開,而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。
常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等,其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應(yīng)用。
電泳后,不可用染色劑直接染色,因為常用的蛋白質(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合,因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì),然后再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ旧?/p>