在進行SSCP前首先要通過PCR擴增出特異性好的產物(瓊脂糖電泳不能有過強的拖尾).
(1)制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG)
按上表制所需的膠液,將梳子插入模子,從梳子一端加入膠,當膠液快到梳齒時,使 模子向加膠端傾斜,繼續慢慢加膠,邊加邊放端模子以防止氣泡形成,室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子,頂部加入1×TBE封閉,備用.
(2)電泳
取10μlPCR產物,加入10μl變性劑(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚藍)、30μl 石蠟油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后將水相全部上樣,10-15℃下 電泳.開始在300V電壓下電泳5min,然后在120V電泳8h,取下凝膠,將其浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30--45min,在紫外燈下觀察,或進行銀染.
(3)銀染法
將PAG板用去離子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去離子水洗 二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去離子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后,用0.75%NaCO3終止顯色.