常用的基因轉染技術是將外源基因導入靶細胞需要一定的載體和導入方法,基因轉技術則是將純化的含有靶基因的質粒DNA送入細胞內,并在細胞內表達。轉染方法有多種,根據不同的細胞,貼壁或懸浮細所可選用不同的方法,其目的是要達到設置轉染效率,影響轉染產率的因素有多種,包括轉染方法、操作技術、質粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態等,下面重點介紹向幾種常用的轉染技術:
被用于作靶基因轉染的細胞,其生長狀態如何,將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞,一般要求在轉染前一日,必需應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養皿或瓶,細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜,轉染當日,在轉染前4小時換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞,也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。
用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其了化學物質的污染,OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準,目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。
具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后,一般在轉染后48小時,靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的,48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。
被用于作靶基因轉染的細胞,其生長狀態如何,將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞,一般要求在轉染前一日,必需應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養皿或瓶,細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜,轉染當日,在轉染前4小時換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞,也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。
用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其了化學物質的污染,OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質粒DNA一般難以達到此標準,目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。
具體的基因轉染技術有鱗酸鈣介導的轉染法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體介導轉染法及電擊基因轉導塵等。靶基因被導入細胞后,一般在轉染后48小時,靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的,48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。