Northern印跡雜交(Northern blot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern于1975年創建,稱為Southern印跡技術,RNA印跡技術正好與DNA相對應,故被稱為Northern印跡雜交,與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。Northern 印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似,只是在進樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性,而不用NaOH,因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合,它同樣可在高鹽中進行轉印,但在烘烤前與膜結合得并不牢固,所以在轉印后用低鹽緩沖液洗脫,否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB,因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小,可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳,之后將標記物切下、上色、照像,樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml
EB的0.1mol/L醋酸銨中10min,光在水中就可脫色,在紫外光下用一次成像相機拍照時,上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光,若接觸太多或在白熾燈下暴露過久,會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時,甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑,但是有毒,因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。
RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。
<1>試劑:
10×MSE緩沖液:0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸鈉,1mmol/L EDTA pH8.0。
5×載樣緩沖液:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚藍。
甲醛:用水配成37%濃度(12.3mol/L),應在通風柜中操作,pH高于4.0。
20×SSC;
去離子甲酰胺;
50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl);
0.1mol/L Tris,pH7.5。
<2>步驟:
[1]40ml水中加7g瓊脂糖,煮沸溶解,冷卻到60℃,加7ml10×MSE緩沖液,11.5ml
甲醛,加水定容至70ml,混勻后倒入盛膠槽。
[2]等膠凝固后,去掉梳子和膠布,將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。
[3]使RNA變性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml,甲醛3.5ml,去離子甲酰胺10ml。
[4]55℃加熱15min,冰浴冷卻。
[5]加2ml5×載樣緩沖液。
[6]上樣、同時加RNA標記物。
[7]60伏電泳過夜。
[8]取出凝膠,水中浸泡2次,每次5min。
[9]室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min,水解高分子RNA,以增強轉印。
[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。
[11]20×SSC洗膠1h。
[12]20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。
[13]取出硝酸纖維素膜,80℃真空烘烤2h。