（一）在豐富培養基中擴增質粒
　　許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養基上的細菌有效，然而在帶有pＭＢl或ＣolEl復制子的高拷貝數質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產量至每500ml培養物２－５mg質粒ＤＮＡ，而且重復性也很好。

１）將30ml含有目的質粒的細菌培養物培養到對數晚期（ＯＤ600約0.6)。培養基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。
２）將含相應抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養基（預加溫至37℃）施放入25ml對數晚期的培養物，于37℃劇烈振搖培養25小時（搖床轉速300轉/分），所得培養物的ＯＤ600值約為0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒（如pUC質粒）可復制達到很高的拷貝數，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。
４）于37℃劇烈振搖（300轉/分），繼續培養12-16小時。
（二）細菌的收獲和裂解

１．收獲
１）用Ｓorvall ＧＳ3轉頭（或與其相當的轉頭）于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
２）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的ＳＴＥ中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細菌細胞。
２．煮沸裂解法
該法[根據Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修訂而成] 可與隨后的純化步驟如氯化鈀－溴化乙錠梯度平衡離心等步驟聯合使用。建議該法只用于經氯霉素處理的培養物，未處理的培養裂解后過于粘稠，不利操作。當從大腸桿菌ＨＢ101或其衍生質粒（包括ＴＧ1）中大量提取質粒時，不宜采用煮沸法。這些細菌釋放大量糖類，在氯化銫－溴化乙錠梯度中與閉環ＤＮＡ形成密度大致相同的區帶。這些糖類還抑制以ＤＮＡ為模反或底物的酶。
１）將500ml 培養物的細菌沉淀物[ 從上述步驟３）獲得] 重懸于用冰預冷的10mlSTET中。
STET
0.1MOL/l nAcl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
將懸液移入50ml錐瓶中。
２）加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉吟于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地發揮作用。
３）用一個夾子把錐瓶放在本生燈的明火上加熱，直至液體恰好開始沸騰，不停地搖晃錐瓶。
４）立即把瓶浸入裝有沸水的大燒杯（2L）中，將瓶放在沸在水中，時間恰為4秒。
５）將瓶浸入用冰預次序的水中５分鐘，使之冷卻。
６）將粘稠狀內容物從瓶中轉移到超離心管（Beckman SW41或與其相當的管），于4℃以30 000轉/分離心30分鐘。原有的細菌增減物生長得越密，應越難將粘稠狀裂解物轉移到離心管中。如有絕對必要，可用長刀片和剪刀將裂解物剪成大小適于操作的大團塊，或軸入10ml注射器的針筒中使之部分剪切。從經用氯霉素處理的細菌培養物中分離質粒ＤＮＡ時，一般不會出現這一問題。如細菌碎片未能形成緊密的團塊，可以35 000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清轉移到另一管內，棄去殘存在管內的粘稠狀液體。
７）將上清轉移到另一管內，純化質粒ＤＮＡ　
３，ＳＤＳ裂解法
本法[根據Ｇodson和Ｖapnek(1973)的方法修訂而成]的產量要低得多，是提取大質粒（大于15kb）的首選方法。
１）將來自500ml培養物的細菌沉淀物[來自收獲細菌的步驟３）] 洗過后重懸于10ml用冰預冷10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將些懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管[橡樹嶺（Oak Ridge)型]中。
２）加2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值小于8.0時，溶菌酶不能有效地發揮作用。
３）加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 將管倒置數次以混勻懸液， 在冰上放置10分鐘。
４）加4ml 10% ＳＤＳ，馬上用一玻棒迅速混勻內容物，使ＳＤＳ均勻分散到整個細菌懸液中，操作應盡可能溫和小心，以便最大限度地避免釋放出來的ＤＮＡ受到剪切。
５）立即加入6ml 5mol/L NaCl（終濃度為1mol/L）， 再次用玻棒溫和地然而卻是徹底地混勻內容物，在冰上放置至少１小時。
６）于4℃用Beckman Ti50型轉頭（或與其相當的轉頭）以30 000轉/分鐘，去掉高分子量ＤＮＡ和細菌碎片。小心將上清轉移到一個50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物。如果細菌碎片貼壁不緊，可用35 000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清轉移到另一管中，去掉存在離心管內的粘稠狀液體。
７）上清用酚：氯仿和氯仿各抽提１次。
８）將水相轉移到－250nl的離心瓶中，于室溫加入２倍體積的（約60ml ）乙醇，充分混勻，于室溫放置1-2小時。
９）于４℃下以5000g離心20分鐘，回收核酸。
10）充上清，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀物，按步驟９）離心，盡可能地去除乙醇，將離心管倒置于紙巾上，使最后殘存的乙醇流干，在真空干燥內短時間干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。
11）用3mlTE(pH8.0)溶解ＤＮＡ。
12）通過氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心純化質粒ＤＮＡ。用聚乙二醇純化質粒時，經過幾次沉淀步驟，大質粒（大于15kb）容易產生切口，所以氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法是純化這種質粒的首選方法。
４，堿裂解法
　　該法是Ｒ．Ｔreisman尚未發表的方法，同時也是Brinboim和Ｄoly(1979)及Ｉsh-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改進。該方法對于目前使用的所有大腸菌菌株都卓有成效，并可與隨后的純化步驟，如驟乙二醇沉淀或氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心等，一并聯合使用。注：括號中給出的體積可適用于未經氯霉素處理的培養。
１）將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟３）] 重懸于10ml（18ml
）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。
當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋）
1％ＳＤＳ
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。
４）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體ＤＮＡ、 高分子量ＲＮＡ和鉀－ＳＤＳ－蛋白質－膜復合物。
５）用ＳorvallＧＳ3轉頭（或與其相當的轉頭）于４℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟４）]。
６）用４層干酪包布把上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
７）用Ｓorvall GS3轉頭（或與其相當的轉頭）于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于４℃離心，鹽也會了生沉淀。
８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
９）用３ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10）用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心或聚乙二醇沉淀。