關鍵詞：蛋白質復性；環(huán)糊精；分子伴侶

重組DNA技術為大規(guī)模生產目標蛋白質提供了嶄新的途徑。但人們在分離純化基因工程表達產物時卻遇到了意想不到的困難：很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產物如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白介素-6、人γ-干擾素等，不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1～3.0μm的固體顆粒棗包含體［1］。這些基因表達產物的一級結構(即氨基酸序列)雖然正確，而其立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。因此，為獲得天然狀態(tài)的目標產物，必須在分離回收包含體后，溶解包含體并設法使其中的目標蛋白質恢復應有的天然構象和活性。這就向生物化學家的蛋白質折疊機制研究提出了新課題。

1. 蛋白質復性機制研究

分離包含體并復性蛋白質的操作步驟并不復雜，從破碎細胞開始，然后將細胞勻漿離心，回收包含體后，加入變性劑溶解包含體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達產物折疊恢復天然構象及活性。但在實際研究中發(fā)現，在體外折疊時，蛋白質分子間由于存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低。究其原因，蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環(huán)境的影響。

為了有的放矢地開發(fā)輔助蛋白質復性的技術，研究工作者紛紛開展了對蛋白質折疊機制的探討。目前有兩種不同的假設：一種假設認為，肽鏈中的局部肽段先形成一些構象單元，如α螺旋、β折疊、β轉角等二級結構，然后再由二級結構單元的組合、排列，形成蛋白質三級結構；另一種假設認為，首先是由肽鏈內部的疏水相互作用導致一個塌陷過程，然后經逐步調整，形成不同層次的結構。盡管是不同的假設，但很多學者都認為有一個所謂‘熔球態(tài)’的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質的二級結構已基本形成，其整體空間結構也初具規(guī)模。此后，分子立體結構再做一些局部調整，最終形成正確的立體結構［2］。總之，蛋白質折疊的具體步驟可用下式描述：

U→I→N
↓
A

即伸展態(tài)U經過早期變化成為中間體I，然后由中間體過渡到最后的天然態(tài)N。但是從中間體折疊為天然態(tài)的同時，另有一條旁路，即中間體相互聚集為凝聚物A(包含體)。在折疊反應中，從伸展態(tài)到中間體的形成是非常快速的，一般在毫秒范圍內完成，但從中間體轉變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢，是反應的限速步驟。當溶液中離子強度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時，聚集趨勢占主導地位，導致蛋白質的自發(fā)復性效率極低。

一般認為，蛋白質在復性過程中，涉及兩種疏水相互作用，一是分子內的疏水相互作用，二是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用。前者促使蛋白質正確折疊，后者導致蛋白質聚集而無活性，兩者互相競爭，影響蛋白質復性收率［3］。因此，在復性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復性收率的關鍵。

2. 蛋白質復性研究的初期成果

80年代后期，人們開展了廣泛的蛋白質復性研究。例如，Carlson等發(fā)現，單克隆抗體具有協助蛋白質復性的作用［4］；Cleland等發(fā)現，向稀釋的變性蛋白質溶液中加入適當濃度的聚乙二醇，可抑制蛋白質復性過程中的凝聚沉淀，使蛋白質復性收率提高兩倍［5］；Hagen等利用反膠團萃取人工變性的蛋白質后去除變性劑進行復性，復性率可達100%［6］(但由于變性劑的存在，萃取率很低)；Batas等利用凝膠過濾色譜介質的分子篩作用可防止變性蛋白質間的接觸和凝聚，輔助其正確折疊［7］；Zardeneta等利用去污劑及混合膠團，成功地輔助了脲變性硫氰酸酶復性［8］。

3. 環(huán)糊精與直鏈糊精輔助蛋白質復性的研究

1995年，Karuppiah 和Sharma發(fā)表文章，介紹了使用環(huán)糊精輔助碳酸酐酶B的復性［9］。環(huán)糊精由淀粉通過環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶降解制得，是由D-吡喃葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵相互結合成互為椅式構象的環(huán)狀低聚糖，其分子通常含有6～12個吡喃葡萄糖單元。有實用意義的是含6、7、8個吡喃葡萄糖單元的α、β、γ-環(huán)糊精，但α-環(huán)糊精空腔較小，γ-環(huán)糊精價格昂貴，常用的是β-環(huán)糊精［10］。環(huán)糊精的特征是能形成包絡化合物，客體分子從寬口端進入其分子空腔。包絡物的形成主要靠非共價鍵相互作用如范德華力、氫鍵、疏水相互作用、幾何形狀匹配等。利用環(huán)糊精的疏水性空腔結合變性蛋白質多肽鏈的疏水性位點，可以抑制其相互聚集失活，從而促進肽鏈正確折疊為活性蛋白質。

1999年，Sundari等報道了用直鏈糊精輔助胰島素、碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復性［11］，發(fā)現直鏈糊精基本上能夠模擬環(huán)糊精在輔助蛋白質復性方面的作用，而且具有這樣一些優(yōu)點：直鏈糊精的螺旋結構形成一個疏水性空管，可以結合更多的蛋白質分子；在水中溶解度較高，有利于提高復性酶濃度和實驗操作；價格比環(huán)糊精便宜，實際應用前景廣闊。?

4. 分子伴侶輔助蛋白質復性的研究

近來，越來越多的有關蛋白質折疊的研究已轉向利用分子伴侶GroE家族。有些學者已成功地利用分子伴侶在體內和體外輔助蛋白質復性［12、13］。但分子伴侶在實際應用中尚存在費用高并需要與復性蛋白質分離等缺點，因此研究開發(fā)分子伴侶的重復利用性及穩(wěn)定性是實現其應用的關鍵。

GroEL具有結合蛋白質的作用，相當于變性蛋白質的親和配基。固定化GroEL柱(固定床)相當于變性蛋白質的親和吸附層析柱，從而可提高樣品的處理量，并使蛋白質在復性的同時得到濃縮和純化。其特點在于：①不僅可以解決分子伴侶的重復利用問題，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侶的利用效率；②由于采用連續(xù)操作，原料處理量大，產品可以得到濃縮、純化；③易于建立相關的模型，對于放大生產具有重要的指導作用。Teshima等利用固定化分子伴侶，在體外輔助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折疊復性［14］。

還有報道利用“小分子伴侶”對目標蛋白質進行復性［15、16］。“小分子伴侶”是指GroEL的一個片段，而這個片段并不是GroEL的水解產物，而是由基因重組后包括GroEL191-345氨基酸殘基片段(16.7kD)或191-376氨基酸殘基片段(21kD)密碼的基因片段在大腸桿菌中的表達產物。它們能有效地促進親環(huán)蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢桿菌RNA酶的復性。由于“小分子伴侶”分子較小，更適合于固定化，且不需另加復性輔助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的應用前景。

5. 人工分子伴侶在蛋白質復性中的應用

受蛋白質分子伴侶輔助蛋白質復性的啟發(fā)，Rozema和Gellman對人工分子伴侶體系(去污劑＋環(huán)糊精)輔助碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復性進行了研究［17、18］。與分子伴侶GroEL＋ATP輔助復性的作用機制相似，其復性過程分為兩步進行：第一步捕獲階段，在變性蛋白質溶液中加入去污劑，去污劑分子通過疏水相互作用與蛋白質的疏水位點結合形成復合體，抑制肽鏈間的相互聚集；第二步剝離階段，加入環(huán)糊精，由于環(huán)糊精分子對去污劑分子有競爭性吸附作用，去污劑分子被剝離下來，從而使多肽鏈在此過程中正確折疊為活性蛋白質［17、18］。其反應機制可用下式表示：

U→U-dn→→→U-dn-m→→→F→N

即伸展態(tài)U首先與去污劑d形成復合物U-dn，加入環(huán)糊精后，小分子去污劑被逐次剝離下來，變?yōu)椴糠终郫B、不含去污劑分子的非活性狀態(tài)F，進而折疊為天然活性蛋白質N。

與GroE等蛋白質分子伴侶相比，聯合使用去污劑和環(huán)糊精作為人工分子伴侶輔助蛋白質復性具有明顯的優(yōu)點：①人工分子伴侶不屬于蛋白質，不易受環(huán)境影響而失活，操作條件較為寬松；②去污劑和環(huán)糊精均可直接購買，省去分離純化的步驟；③去污劑與環(huán)糊精的分子量較小，容易與蛋白質分離，有利于提高工業(yè)生產效率。?

參考文獻

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(本文原刊登在《生命的化學》2000年第6期)