基因組序列的迅速獲得推動了一門新興學(xué)科——功能基因組學(xué)的發(fā)展，這一學(xué)科重點關(guān)注基因功能的變化。擴增性片段長度多態(tài)性（Amplified restriction fragment length polymorphism，AFLP）分析以及反向遺傳學(xué)都是功能基因組學(xué)的重要組成部分。
傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)，例如用轉(zhuǎn)座子（transposon）敲除特定基因，雖然可以準(zhǔn)確測定表型，但需要進行耗時的轉(zhuǎn)基因或復(fù)雜的組織培養(yǎng)。而且由于這種基因敲除的方法將整個基因敲除，無法觀察到活性基因功能部分缺失的結(jié)果。
為克服此基因敲除方法的局限性，進一步獲得關(guān)于活性基因突變的信息，F(xiàn)red Hutchinson癌癥研究中心的研究者們發(fā)明了一種定向誘導(dǎo)基因組局部突變（TILLING： Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技術(shù)。該方法具有簡單高效的特點，它利用化學(xué)突變方法來獲得所有基因的傳統(tǒng)的點突變等位基因系列。對那些表型分析時會牽涉到亞致死等位基因的重要基因，TILLING的方法具有其獨特的優(yōu)勢。隨著TILLING方法有效應(yīng)用到越來越多的生物種類，如果蠅，擬南芥，斑馬魚，玉米等，它在遺傳學(xué)研究方面的重要價值也越發(fā)體現(xiàn)出來。
但由于點突變一般很難被檢測出來，一直是TILLING技術(shù)應(yīng)用上的一個障礙。要得到好的結(jié)果，要求檢測儀器不僅靈敏度高，還能夠識別假陽性位點。我們在這兒給大家引薦一種更簡便，靈敏，準(zhǔn)確的高通量TILLING分析技術(shù)：雙色紅外熒光檢測技術(shù)。
雙色紅外熒光檢測技術(shù)是美國LI-COR公司的專利技術(shù)。LI-COR長期致力于此項技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用，他們開發(fā)的Odyssey雙色熒光掃描系統(tǒng)及DNA遺傳分析系統(tǒng)都取得了很大成功。由于雜質(zhì)、干擾分子在紅外區(qū)幾乎不發(fā)光，用紅外熒光進行檢測的背景非常低，靈敏度很高，可檢測到低達15amoles的熒光分子。加上雙通道檢測（680nm激發(fā)，710nm檢測；780nm激發(fā)，820nm檢測），兩個通道檢測波長相距110nm，相對于通常的可見熒光四色檢測來說，幾乎沒有光譜重疊的干擾（見下圖），保證了TILLING分析中每一個突變堿基的準(zhǔn)確識別及整個檢測的靈敏度。
以下就具體給大家介紹雙色紅外熒光檢測技術(shù)在反向遺傳學(xué)中與TILLING法結(jié)合的應(yīng)用，及基于雙色紅外熒光檢測技術(shù)的LI-COR 4300 DNA分析系統(tǒng)與之相應(yīng)的技術(shù)優(yōu)勢。
紅外熒光檢測技術(shù)在反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用
將紅外檢測技術(shù)同TILLING技術(shù)結(jié)合，其優(yōu)勢已經(jīng)被全世界許多實驗室證實。美國國家科學(xué)基金會植物基因組計劃（NSF Plant Genome Research Program (PGRP)）近年來大力發(fā)展高通量TILLING，并直接推動了以美國為首的北美實驗室聯(lián)合啟動擬南芥 TILLING項目（ATP：Arabidopsis TILLING Project）。該項目組使用 LI-COR DNA 分析系統(tǒng)在其成立的第一年就為擬南芥研究者們提供了100多個基因上的1000多個突變位點。本文就以此為例來介紹紅外熒光檢測技術(shù)在反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用。
1 對擬南芥種子進行誘導(dǎo)處理產(chǎn)生一系列點突變
2 將種子培養(yǎng)，獲得第一代擬南芥突變個體
3 第一代植株自花授粉，產(chǎn)生第二代
4 將第二代植株種子收集，抽提DNA，存放于96孔板
5 將多個96孔板的樣本合并到1個96孔板內(nèi)（最多可合并8個），用兩對特異性引物進行PCR擴增，兩對引物分別用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記。
6 對擬南芥種子進行誘導(dǎo)處理產(chǎn)生一系列點突變
7 將種子培養(yǎng)，獲得第一代擬南芥突變個體
8 將第二代植株種子收集，抽提DNA，存放于96孔板
9 分別得到700nm和800nm兩張圖。發(fā)生突變的泳道，在700nm的圖上可以在野生型條帶下方看到一個條帶，同時在800nm的圖上相同的泳道也會有一個條帶，這兩個條帶就是CEL I核酸酶的剪切產(chǎn)物，兩個條帶片斷大小之和等于擴增片段的大小，從而很容易對擴增產(chǎn)物進行突變檢測
10 當(dāng)混合樣本檢測到突變后，要對混合樣本中的每個DNA樣本再次進行篩選，檢測出發(fā)生突變的DNA樣本。
TILLING技術(shù)路線
技術(shù)關(guān)鍵一：獲得高質(zhì)量的TILLING圖像
將紅外熒光檢測技術(shù)與TILLING技術(shù)結(jié)合后，可以同時獲得兩張真實的電泳圖像（700nm和800nm）。應(yīng)用TILLING技術(shù)時，獲得未經(jīng)修改的圖像原始數(shù)據(jù)對于檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性都很重要。如果檢測系統(tǒng)在檢測時對熒光數(shù)據(jù)已經(jīng)進行了處理，很可能會過濾掉大部分甚至是全部的突變信息。
技術(shù)關(guān)鍵二：雙色成像能有效排除假陽性突變
通過PCR反應(yīng)得到的異源核酸雙鏈分子在堿基錯配處被切斷。由于兩個剪切片斷采用不同的熒光染料標(biāo)記，如果真的發(fā)生了突變，雙色檢測時將在野生型條帶下面出現(xiàn)兩個突變條帶，分別位于700nm和800nm電泳圖的同一泳道。同時，這兩個突變條帶的分子量之和應(yīng)該等于野生型條帶的分子量，因而雙色檢測能夠有效排除假陽性點突變，準(zhǔn)確度很高。
技術(shù)關(guān)鍵之三：高靈敏度的紅外檢測
由于核酸外切酶活性會導(dǎo)致一些信號丟失，應(yīng)用紅外檢測技術(shù)提高靈敏度對于TILLING檢測非常重要。紅外熒光檢測相對可見光檢測具有背景低、靈敏度高的優(yōu)點。此外，結(jié)合紅外熒光染料后，該檢測方法還具有另一個優(yōu)點——寬廣的線性范圍。這一特點使得強信號和弱信號能夠同時被分辨，當(dāng)野生型條帶的信號強，突變型條帶信號弱時，LI-COR DNA分析系統(tǒng)也能夠輕松識別突變。
高通量的突變篩選
結(jié)合4300分析系統(tǒng)，TILLING作為一種高通量的篩選技術(shù)，其通量可達到：
每塊膠可檢測750，000堿基對
每天可檢測2000樣本
每天可檢測2百萬堿基對
每個樣本可檢測1000個堿基
應(yīng)用Tilling 技術(shù)發(fā)表的一些文獻：
1. Till, B.J., Reynolds, S.H., Greene, E.A., Codomo, C.A., Enns, L.C., Johnson, J.E., Burtner, C., Odden, A.R., Young K., Taylor, N.E., Henikoff, J.G., Comai, L., and Henikoff, S. 2003. Large-Scale Discovery of Induced Point Mutations With High-Throughtput TILLING. Genome Research 13:524-530.
2. Henikoff, S., and Comai, L. 2003. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54:15.1-15.27.
3. Colbert, T., Till, B.J., Tompa, R., Reynolds, S., Steine, M.N., Yeung, A.T., McCallum, C.M., Greene, Comai, L., and Henikoff, S. 2001. High Throughtput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiology 126: 480-484.
4. McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. 2000. Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics. Plant Physiology 123:439–442.
紅外熒光檢測技術(shù)在AFLP研究中的應(yīng)用
除了以上提到的反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用外，紅外熒光檢測技術(shù)在AFLP研究中的應(yīng)用也日益廣泛。該領(lǐng)域的許多文章都使用LI-COR DNA 分析系統(tǒng)完成。LI-COR公司針對 AFLP研究提供包括試劑、儀器、分析軟件在內(nèi)的全套AFLP分析解決方案，不僅能進行傳統(tǒng)的基因組AFLP分析，還提供專門的試劑盒進行表達性的cDNA AFLP分析，如果結(jié)合LI-COR的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，還可將AFLP電泳條帶回收進行進一步的研究，為研究者提供了極大的便利。分析軟件方面，LI-COR公司秉承了其“功能細致強大，自動化程度高”的一貫優(yōu)點，僅針對AFLP一項就有Gene ImagIRTM, SAGAMX, AFLP QuantarTM Pro三種不同的軟件，分別滿足一般性用戶、專業(yè)用戶和特殊的共顯性分析的需要，徹底解決了數(shù)據(jù)分析的瓶頸制約。
AFLP相關(guān)文獻：
1. Identification on Commercialized Products of AFLP Markers Able To Discriminate Slow- from Fast-Growing Chicken Strains。OLIVIER FUMIEÅ RE,*,† MARC DUBOIS,† DIMITRIE GREÄ GOIRE,† ANDREÄ THEÄ WIS,‡ ANDGILBERT BERBEN†J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1115-1119
2. High-Throughput AFLP® Analysis Using Infrared Dye-Labeled Primers and anAutomated DNA Sequencer. A.A. Myburg, D.L. Remington, D.M. O'malley, R.R.Sederoff, and R.W. Whetton. BioTechniques 2001, 30(2): 348-357.
3. Construction of an AFLP® genetic map with nearly complete genome coverage in Pinus taeda. D.L. Remington, R.W. Whetten, B.-H. Liu, D.M. O'Malley.Theoretical Applied Genetics 1999, 98:1279-1292.
4. NA Inter-MITE polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genomema pping and fingerprinting approach. R.-Y. Chang, L.S. O'Donoughue, and T.E. Bureau. Theoretical Applied Genetics 2001, 102:773-781.
