大規模基因組測序計劃的實施已改變生命科學的重心，在相當短的時期內，一些原核生物和某些低等真核生物的基因組序列已被測定. 1995年，流感嗜血桿菌基因組序列首次被破譯，在此后不到兩年的時間，近50個細菌的基因組序列已被完成. 然而，這僅僅是理解有機物功能的一個起點. 在基因組時代，許多DNA序列信息僅提供相關基因組的結構和功能. 然而，對基因產物（mRNA和蛋白質）的理解是理解細胞生物學的一個不可缺少的部分. DNA序列信息不能預測：1)基因表達產物是否或何時被翻譯；2)基因產物的相應含量；3)翻譯后修飾的程度；4)基因剔除或過表達的影響；5)遺留的小基因或<300 bp的ORFs的出現；6)多基因現象的表型. 此外，mRNA水平的測量并不能完全揭示細胞調節；且蛋白質的樣品較mRNA 穩定；蛋白質和mRNA之間的相關系數僅為0.4～0.5，還存在轉錄后加工、翻譯調節以及翻譯后加工等. 故而，“基因組時代”的迅猛發展同時激起了人們對“后基因組時代”中蛋白質組研究的需求.
1 蛋白質組的含義
蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. ?
蛋白質組學(Proteomics)處于早期“發育”狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中于動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究并非從零開始，它是已有20年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離后的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
2 蛋白質組研究的核心 用于分離的雙向電泳(2-DE)
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離. 目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質. 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 近來， 在“變性劑雞尾酒”中，含14～16個碳的磺基甘氨酸三甲內鹽(ASB14～16)的裂解液效果最好. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰. 亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標準)、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點. 由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性. ?
2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match). 對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎. 第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte, CA)，在管膠內建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失. 因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題. IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性. 目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性. 目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術. 銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質檢測. 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.
較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術.
3 蛋白質組技術的支柱---鑒定技術(Identification)
如果目前分離蛋白質組的最好技術是2-DE，那么隨之而來的挑戰是數百數千個蛋白如何被鑒定. 在這里，我們不考慮傳統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達. 并不是因為這些方法無效，而是因為它們通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選. 目前，所選用的技術包括對于蛋白鑒定的圖象分析、微量測序；進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術.
(1) 圖象分析技術(Image analysis). “滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析. 在一系列高質量的2-DE凝膠產生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建. 首先，采集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機；激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro?imagers，對圖象進行數字化. 并成為以象素(pixels)為基礎的空間和網格. 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測. 利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區域與背景分離，精確限定斑點的強度、面積、周長和方向. 圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致. 在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟件可精確描述斑點外觀，并進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度. 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界. 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟件包. 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化. 由于在2-DE中出現100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對于圖象分析系統是一個挑戰. IPG技術的出現已使斑點配比變得容易. 因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測. 用來配比的著名軟件系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用，而神經網絡、子波變換和實用分析在未來可被采用. 配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為“路標”，進行交叉配比. 之后，擴展至整個膠. 例如：精確的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW. 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網絡，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配. 所估計的精確度大大依賴于所建網格的結構及標本的類型. 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0.25個單位. 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數據庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量. 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大. 故需聯合其他的技術完成鑒定. ?
(2) 微量測序(microsequencing). 蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息. 盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術. 目前已實現蛋白質微量測序的自動化. 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質的鑒定. 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生；與質譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$. 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質. 然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序.
近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用于Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定. 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質組中進行鑒定.若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質. 選擇BLAST程序，可與數據庫相配比. 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用.
(3) 與質譜(mass spectrometry)相關的技術. 質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門. 用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，1)樣品入機的離子源，2)測量被介入離子的分子量的裝置. 首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術. 它從固相標本中產生離子，并在飛行管中測其分子量. 其次是電噴霧質譜(ESI-MS)，是一連續離子化的方法，從液相中產生離子,聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量. 近年來，質譜的裝置和技術有了長足的進展. 在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當精確的分子量. 在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能. 將反相液相色譜和串聯質譜(tandem MS)聯用，可在數十個picomole的水平檢測；若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小于femtomole的水平檢測［25］. 甚至可在attomole水平進行. 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用鑒定蛋白質. 下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質.
1)肽質指紋術(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出. 用酶(最常用的是胰酶)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量(MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術能夠完成的肽質量可精確到0.1個分子量單位. 所有的肽質量最后與數據庫中理論肽質量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產生的). 配比的結果是按照數據庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，“冠軍”肽片段可能代表一個未知蛋白.若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大.
2)肽片段(peptide fragment)的部分測序. 肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質. 為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段. 用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide). 首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量. 另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段. 化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸(128.09)和谷氨酰胺(128.06). 或者，在質譜儀內應用源后衰變(post-source decay, PSD)和碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)，目的是產生包含有僅異于一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜. 因此，允許推斷肽片段序列. 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息. 首先進行肽質指紋鑒定. 之后，一個有意義的肽片段在質譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應器的過程中降解為“子離子”. 在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段. 但經常產生不完全的片段. 現在用肽片段來測序的方法始于70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成. 在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量. 與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列. 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量. 由此，序列可被推測. 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標簽”. 這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N-、C?端的距離將足以鑒定一個蛋白質.
(4) 氨基酸組分分析. 1977年首次作為鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的“腳印”技術. 利用蛋白質異質性的氨基酸組分特征，成為一種獨立于序列的屬性，不同于肽質量或序列標簽. Latter首次表明氨基酸組分的數據能用于從2-DE凝膠上鑒定蛋白質. 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自動衍生并由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周. 依據代表兩組分間數目差異的分數，對數據庫中的蛋白質進行排榜，“冠軍”蛋白質具有與未知蛋白質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差異，僅處于冠軍的蛋白質的可信度大. Internet上存在多個程序可用于氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質. 但仍存在一些缺點，如由于不足的酸性水解或者部分降解會產生氨基酸的變異. 故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定.
4 蛋白質組研究的百科全書 數據庫(database)
蛋白質組數據庫(proteome database)被認為是蛋白質組知識的儲存庫，包含所有鑒定的蛋白質信息，如蛋白質的順序、核苷酸順序、2-D PAGE、3-D結構、翻譯后的修飾、基因組及代謝數據庫等. 例如，SWISS-2DPAGE數據庫包括人類，細菌，細胞等物種的信息. 其中，E.coli SWISS-2DPAGE數據庫是EXPASY分子生物學服務器的一部分，通過www的URL網址http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html可以查詢.
當前的計算機和網絡技術，讓我們將所有的數據庫連在一起，并允許我們從一個數據庫中的一條信息遨游到其他的數據庫；將一個研究對象的數據與其他各種蛋白質組中的相關數據或圖譜相連. 分析型軟件工具被稱為蛋白質組分析機器人、數據分析軟件包. 在既定的狀態下，定量研究蛋白質的表達水平，或者計算機輔助數據庫系統建立可將實驗推進一步.因此，蛋白質組分析技術聯合蛋白質數據庫，計算機網絡和其他軟件包合在一起稱為蛋白質組的機控百科全書(Cyber-encyclopaedia of the proteome).
蛋白質組和基因組共同分析可以產生大量的數據. 當評估每一個數據庫的價值時，難免要考慮兩個條件：1)數據庫是否在任一時刻保持最新；2)何時能夠相互連接，且以整體狀態評估. 目前的發展趨勢：1)信息量呈指數增長；2)蛋白質組計劃的實施會產生新的數據庫；3)致力于模擬細胞內蛋白質的相互作用的新型數據庫；4)建立高級、智慧型的咨詢工具是必需的.
5 蛋白質組技術的規模 高流通量篩選（HTS）
HTS(High throughput screening)至今在蛋白質組研究中已成為現實. 在最近的一年內，由于制藥工業對此的需求，樣品輸入自動化得以進展. 目前，正在設計的機器人可自動處理2-DE后電轉至PVDF膜. 原形機器人加工、傳輸蛋白質至質譜或以液相色譜為基礎的分析儀，如進行斑點切割，操縱、控制多種PMF、氨基酸組分分析所需的化學反應，使每天最小的流通量達1000個蛋白. 此外，必須選擇適用的軟件包，如應用第二代COMBINED來處理輸出的數據，自動咨詢本地或網上的數據庫而進行系列的評估. 大量的數據分析表明HTS是刻不容緩的. 目前，對質譜已設想一個三級方案來處理大規模的蛋白質組：1）MALDI-TOF-MS以每天大于1000個蛋白的速率分析；2）通過ESI-MS/MS或SEQUEST，以每天每臺機器分析幾打蛋白質的速率進行序列標簽；3）對由串聯質譜所得的新蛋白或有意義蛋白進行全長肽段的測序，從而提供足夠的信息通過核酸探針或簡并PCR引物獲得有意義的基因.
綜上所述,高分辨率、高敏感性和高流通性的分離和分離后鑒定技術,結合準確、全面的數據庫技術, 使蛋白質組技術用于生物研究卓有成效. 但僅鑒定蛋白質是不夠的，蛋白質組世界的挑戰是完善蛋白質質和量的分析,設想細胞活性、功能的全體性概念. 在此基礎上,蛋白質組分析將會促進未來生命科學的整體發展.
1 蛋白質組的含義
蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. ?
蛋白質組學(Proteomics)處于早期“發育”狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中于動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究并非從零開始，它是已有20年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離后的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
2 蛋白質組研究的核心 用于分離的雙向電泳(2-DE)
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離. 目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質. 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 近來， 在“變性劑雞尾酒”中，含14～16個碳的磺基甘氨酸三甲內鹽(ASB14～16)的裂解液效果最好. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰. 亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標準)、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點. 由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性. ?
2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match). 對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎. 第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte, CA)，在管膠內建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失. 因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題. IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性. 目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性. 目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術. 銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質檢測. 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.
較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術.
3 蛋白質組技術的支柱---鑒定技術(Identification)
如果目前分離蛋白質組的最好技術是2-DE，那么隨之而來的挑戰是數百數千個蛋白如何被鑒定. 在這里，我們不考慮傳統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達. 并不是因為這些方法無效，而是因為它們通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選. 目前，所選用的技術包括對于蛋白鑒定的圖象分析、微量測序；進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術.
(1) 圖象分析技術(Image analysis). “滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析. 在一系列高質量的2-DE凝膠產生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建. 首先，采集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機；激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro?imagers，對圖象進行數字化. 并成為以象素(pixels)為基礎的空間和網格. 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測. 利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區域與背景分離，精確限定斑點的強度、面積、周長和方向. 圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致. 在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟件可精確描述斑點外觀，并進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度. 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界. 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟件包. 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化. 由于在2-DE中出現100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對于圖象分析系統是一個挑戰. IPG技術的出現已使斑點配比變得容易. 因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測. 用來配比的著名軟件系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用，而神經網絡、子波變換和實用分析在未來可被采用. 配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為“路標”，進行交叉配比. 之后，擴展至整個膠. 例如：精確的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW. 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網絡，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配. 所估計的精確度大大依賴于所建網格的結構及標本的類型. 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0.25個單位. 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數據庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量. 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大. 故需聯合其他的技術完成鑒定. ?
(2) 微量測序(microsequencing). 蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息. 盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術. 目前已實現蛋白質微量測序的自動化. 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質的鑒定. 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生；與質譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$. 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質. 然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序.
近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用于Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定. 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質組中進行鑒定.若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質. 選擇BLAST程序，可與數據庫相配比. 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用.
(3) 與質譜(mass spectrometry)相關的技術. 質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門. 用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，1)樣品入機的離子源，2)測量被介入離子的分子量的裝置. 首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術. 它從固相標本中產生離子，并在飛行管中測其分子量. 其次是電噴霧質譜(ESI-MS)，是一連續離子化的方法，從液相中產生離子,聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量. 近年來，質譜的裝置和技術有了長足的進展. 在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當精確的分子量. 在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能. 將反相液相色譜和串聯質譜(tandem MS)聯用，可在數十個picomole的水平檢測；若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小于femtomole的水平檢測［25］. 甚至可在attomole水平進行. 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用鑒定蛋白質. 下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質.
1)肽質指紋術(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出. 用酶(最常用的是胰酶)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量(MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術能夠完成的肽質量可精確到0.1個分子量單位. 所有的肽質量最后與數據庫中理論肽質量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產生的). 配比的結果是按照數據庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，“冠軍”肽片段可能代表一個未知蛋白.若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大.
2)肽片段(peptide fragment)的部分測序. 肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質. 為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段. 用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide). 首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量. 另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段. 化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸(128.09)和谷氨酰胺(128.06). 或者，在質譜儀內應用源后衰變(post-source decay, PSD)和碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)，目的是產生包含有僅異于一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜. 因此，允許推斷肽片段序列. 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息. 首先進行肽質指紋鑒定. 之后，一個有意義的肽片段在質譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應器的過程中降解為“子離子”. 在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段. 但經常產生不完全的片段. 現在用肽片段來測序的方法始于70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成. 在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量. 與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列. 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量. 由此，序列可被推測. 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標簽”. 這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N-、C?端的距離將足以鑒定一個蛋白質.
(4) 氨基酸組分分析. 1977年首次作為鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的“腳印”技術. 利用蛋白質異質性的氨基酸組分特征，成為一種獨立于序列的屬性，不同于肽質量或序列標簽. Latter首次表明氨基酸組分的數據能用于從2-DE凝膠上鑒定蛋白質. 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自動衍生并由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周. 依據代表兩組分間數目差異的分數，對數據庫中的蛋白質進行排榜，“冠軍”蛋白質具有與未知蛋白質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差異，僅處于冠軍的蛋白質的可信度大. Internet上存在多個程序可用于氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質. 但仍存在一些缺點，如由于不足的酸性水解或者部分降解會產生氨基酸的變異. 故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定.
4 蛋白質組研究的百科全書 數據庫(database)
蛋白質組數據庫(proteome database)被認為是蛋白質組知識的儲存庫，包含所有鑒定的蛋白質信息，如蛋白質的順序、核苷酸順序、2-D PAGE、3-D結構、翻譯后的修飾、基因組及代謝數據庫等. 例如，SWISS-2DPAGE數據庫包括人類，細菌，細胞等物種的信息. 其中，E.coli SWISS-2DPAGE數據庫是EXPASY分子生物學服務器的一部分，通過www的URL網址http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html可以查詢.
當前的計算機和網絡技術，讓我們將所有的數據庫連在一起，并允許我們從一個數據庫中的一條信息遨游到其他的數據庫；將一個研究對象的數據與其他各種蛋白質組中的相關數據或圖譜相連. 分析型軟件工具被稱為蛋白質組分析機器人、數據分析軟件包. 在既定的狀態下，定量研究蛋白質的表達水平，或者計算機輔助數據庫系統建立可將實驗推進一步.因此，蛋白質組分析技術聯合蛋白質數據庫，計算機網絡和其他軟件包合在一起稱為蛋白質組的機控百科全書(Cyber-encyclopaedia of the proteome).
蛋白質組和基因組共同分析可以產生大量的數據. 當評估每一個數據庫的價值時，難免要考慮兩個條件：1)數據庫是否在任一時刻保持最新；2)何時能夠相互連接，且以整體狀態評估. 目前的發展趨勢：1)信息量呈指數增長；2)蛋白質組計劃的實施會產生新的數據庫；3)致力于模擬細胞內蛋白質的相互作用的新型數據庫；4)建立高級、智慧型的咨詢工具是必需的.
5 蛋白質組技術的規模 高流通量篩選（HTS）
HTS(High throughput screening)至今在蛋白質組研究中已成為現實. 在最近的一年內，由于制藥工業對此的需求，樣品輸入自動化得以進展. 目前，正在設計的機器人可自動處理2-DE后電轉至PVDF膜. 原形機器人加工、傳輸蛋白質至質譜或以液相色譜為基礎的分析儀，如進行斑點切割，操縱、控制多種PMF、氨基酸組分分析所需的化學反應，使每天最小的流通量達1000個蛋白. 此外，必須選擇適用的軟件包，如應用第二代COMBINED來處理輸出的數據，自動咨詢本地或網上的數據庫而進行系列的評估. 大量的數據分析表明HTS是刻不容緩的. 目前，對質譜已設想一個三級方案來處理大規模的蛋白質組：1）MALDI-TOF-MS以每天大于1000個蛋白的速率分析；2）通過ESI-MS/MS或SEQUEST，以每天每臺機器分析幾打蛋白質的速率進行序列標簽；3）對由串聯質譜所得的新蛋白或有意義蛋白進行全長肽段的測序，從而提供足夠的信息通過核酸探針或簡并PCR引物獲得有意義的基因.
綜上所述,高分辨率、高敏感性和高流通性的分離和分離后鑒定技術,結合準確、全面的數據庫技術, 使蛋白質組技術用于生物研究卓有成效. 但僅鑒定蛋白質是不夠的，蛋白質組世界的挑戰是完善蛋白質質和量的分析,設想細胞活性、功能的全體性概念. 在此基礎上,蛋白質組分析將會促進未來生命科學的整體發展.
