物理圖是指標明一些界標（例如限制酶的切點、基因等）在DNA上的位置，圖距以物理長度為單位，例如染色體的帶區、核苷酸對數目等。人類基因組計劃的研究目標是，構建人的每條染色體的STS圖，標記之間相距約10Okb。獲得一組組DNA片段的克隆，組內兩兩片段之間有共同的重疊序列；或是獲得標記按正確次序排列、相互毗鄰的片段，其連續長度超過2000kb，以便把染色體分段進行研究。
最通常的物理圖的構建方法是把限制酶切的DNA片段，按其次序排列連接起來。作圖的技術路線基本上分兩類：一類是由長到短作圖，另一類則是由短到長作圖。前者是將基因組DNA用切點很少的限制酶如NotI等完全酶切，得到長約100～l000kb的DNA長（大）片段，每條染色體平均切成130個片段，按照片段上的標記把片段按次序排列，然后再把每一長片段酶切成短片段，再把短片段排列成序。這是由長到短的作圖，圖比較完整但分辨率低。后一類方法則是先將基因組DNA用限制酶作部分酶切，得到的短片段分別用酵母人工染色體（YAC）或粘粒等作載體加以克隆，然后根據克隆片段兩端共有的序列即重疊序列，兩兩連接，逐漸延伸成長片段。這樣作圖分辨率較高，但圖不完整往往留有空缺。這是因為有些酶切產生的DNA片段太短，不易被克隆，以致在通過重疊序列把片段連接時出現中斷。一組相互鄰接的DNA片段的克隆稱為鄰接DNA片段組（contig）。目前一個contig通常只有2～6個粘粒克隆，即所含的DNA片段相加只有100～300kb，如除去兩兩片段的重疊序列，則一個contig作圖覆蓋的DNA長度是有限的。現在要求在5年內做到一個contig能覆蓋2000kb DNA，并帶有幾個標記。
    在制作物理圖時，重點發展的幾種實驗技術是：（1）脈沖電場凝膠電泳，這是分離高分子量DNA的一種電泳技術，使DNA分子處在兩個相互垂直、交替更換的電場中移動，把分子量不同的DNA片段分開，可分辨50kb至200kb的DNA分子。（2）YAC克隆：YAC是由質粒pBR322、酵母的著絲粒、四膜蟲rDNA的端粒、酵母的自主復制序列（ARS）以及一些選擇標記基因構成。呈環狀結構時，可以質粒方式在原核細胞中增殖復制。切成線狀結構后，可連同插入的外源DNA，如染色體一樣地在酵母細胞中復制、分配給子細胞。YAC作為載體，克隆的外源DNA平均300kb，最長的可達100Okb，穩定地傳遞給子細胞。設計構建YAC時，在原核生物的復制起點〔Ori）上游安排一個限制酶切位點（如XhoI），當YAC載 有外源DNA后，只需用Xhol酶切，則靠近克隆位點的外源DNA上的XhoI切點，可與YAC的XhoI切點互補結合呈環狀，按質粒進行復制和被回收。這種技術稱為質粒獲救。用這種方法可把外源DNA的末端分離出來，作為釣取與其鄰接的、具有共同末端序列亦即重疊序列的另一DNA片段的探針。實際上這也就是染色體步移的操作。（3）PCR（多聚酶鏈反應）：體外擴增DNA的技術，在生物學、醫學等基礎研究和臨床診斷上有極其廣泛的用途。在構建基因組物理圖時，主要用于驗證STS。（4）熒光原位雜交：傳統的以同位素標記探針作原位雜交，曝光后的顆粒較粗，定位不易精確。正在研究以熒光染料代替同位素，提高定位的精確度。（5）輻射雜種細胞分析，這是利用體細胞遺傳學的方法構建高分辨的染色體圖的技術。人-鼠雜種細胞接受射線輻照后，染色體斷裂，篩選出保留缺失程度不同的人染色體的雜種細胞，可用于構建大尺度染色體物理圖。