（一）相差顯微鏡的特點

相差顯微鏡是一種將光線通過透明標本細節時所產生的光程差（即相位差）轉化為光強差的特種顯微鏡。

光線通過比較透明的標本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化。因此，用普通光學顯微鏡觀察未經染色的標本（如活的細胞）時，其形態和內部結構往往難以分辨。然而，由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發生改變（產生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置--環狀光闌和相板，利用光的干涉現象，將光的相位差轉變為人眼可以察覺的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增強，使我們能比較清楚的觀察到普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內的某些細微結構。

（二）相差顯微鏡的成像原理

鏡檢時光源只能通過環狀光闌的透明環，經聚光器后聚成光束，這束光線通過被檢物體時，因各部分的光程不同，光線發生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環所成的像恰好落在物鏡后焦點平面和相板上的共軛面重合。因此，未發生偏斜的直射光便通過共軛面，而發生偏斜的衍射光則經補償面通過。由于相板上的共軛面和補償面的性質不同，它們分別將通過這兩部分的光線產生一定的相位差和強度的減弱，兩組光線再經后透鏡的會聚，又復在同一光路上行進，而使直射光和衍射光產生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時，通過無色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。

（三）相差顯微鏡的結構和裝置

相差顯微鏡與普通光學顯微鏡的基本結構是相同的，所不同的是它具有四部分特殊結構：即環狀光闌、相板、合軸調節望遠鏡及綠色濾光片。

1、環狀光闌 具有環形開孔的光闌。位于聚光器的前焦點平面上，光闌的直徑大小是與物鏡的放大倍數相匹配的，并有一個明視場光闌，與聚焦器一起組成轉盤聚光器。在使用時只要把相應的光闌轉到光路即可。

2、相板 位于物鏡內部的后焦平面上。相板上有兩個區域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補償面”。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常以“Ph”字樣標在物鏡外殼上。

相板上鍍有兩種不同的金屬膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常為鉻、銀等金屬在真空中蒸發而鍍成的薄膜，它能把通過的光線吸收掉60%-93%，相位膜為氟化鎂等在真空中蒸發鍍成，它能把通過的光線相位推遲1/4波長。

根據需要，兩種膜有不同的鍍法，從而制造出不同類型的相差物鏡。如果吸收膜和相位膜都鍍在相反的共軛面上，通過共軛面的直射光不但振幅減弱，而且相位也被推遲1/4λ，衍射光因通過物體時相位也被推遲1/4λ，這樣就使得直射光與衍射光維持在同一個相位上。根據相長干涉原理，合成光等于直射光與衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通過被檢物體的合成光就比背景明亮。這樣的效果叫負相差，鏡檢效果是暗中之明。

如果吸收膜鍍在共軛面，相位膜鍍在補償面上，直射光僅被吸收，振幅減少，但相位未被推遲，而通過補償面的衍射光的相位，則被推遲了兩個1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根據相消干涉原理，這樣通過被檢物體的合成光要比背景暗，這種效果叫正相差，即鏡檢效果是明中之暗。

負相差物鏡（Negative　contrast）用縮寫字母“N”表示，正相差物鏡（Positive contrast）用縮寫字母“P”表示，由于吸收膜對通過它的光線的透過率不同，可分為高、中、低及低低，如Olympus光的透過率分為：7%、15%、20%、40%四個等級，因此分為高（High略寫為H），中（Medium略寫為M），低（Low略寫為L）及低低（Low-Low略寫成LL）四類，構成了負高（NH）、負中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四種類型相差物鏡，這些字母符號都寫在相差物鏡的外殼上。可根據被檢物體的特性來選擇使用不同類型的相差物鏡。

3、合軸調節望遠鏡 是相差顯微鏡一個極為重要的結構。環狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合，才能實現對直射光和衍射光的特殊處理。否則應被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達到相差鏡檢的效果。由于環狀光闌是通過轉盤聚光器與物鏡相匹配的，因而環狀光闌與相板常不同軸。為此，相差顯微鏡配備有一個合軸調節望遠鏡（在鏡的外殼上標有“CT”符號），用于合軸調節。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節望遠鏡，旋轉合軸調節望遠鏡的焦點，便能清楚看到一明一暗兩個圓環。再轉動聚光器上的環狀光闌的兩個調節鈕，使明亮的環狀光闌圓環與暗的相板上共軛面暗環完全重疊。如明亮的光環過小或過大，可調節聚光器的升降旋鈕，使兩環完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應更換。調好后取下望遠鏡，換上目鏡即可進行鏡檢觀察。

4、綠色濾光片 由于使用的照明光線的波長不同，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整光源的波長。Olympus廠家生產的相差顯微鏡在鏡檢時要使用該廠規定的IF550綠色濾光片作為配套器件。

（四）相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項

1、使用范圍 相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細節，適用于對活體細胞生活狀態下的生長、運動、增殖情況及細微結構的觀察。因此，是微生物學、細胞生物學、細胞和組織培養、細胞工程、雜交瘤技術等現代生物學研究的必備工具。

2、操作步驟

（1）根據觀察標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。

（2）將標本片放到載物臺上。

（3）進行光軸中心的調整。

（4）取下一側目鏡，換上合軸調節望遠鏡，調整環狀光闌與相板上的共軛面圓環完全重疊吻合，然后取下合軸調節望遠鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數時，必須重新進行環狀光闌與相板共軛面圓環吻合的調整。

（5）放上綠色濾光片，即可進行鏡檢，鏡檢操作與普通光學顯微鏡方法相同。

3、注意事項

（1）視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強。因環狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。

（2）不同型號的光學部件不能互換使用。

（3）載玻片、蓋玻片的厚度應遵循標準，不能過薄或過厚。

（4）切片不能太厚，一般以5-10μm為宜，否則會引起其他光學現象，影響成像質量。