本要點適用于供治療的體內診斷用的利用雜交瘤技術制備的單克隆抗體，適用于在人體內應用的利用重復DNA技術制備的基因工程抗體

一、雜交瘤技術制備的單克隆抗體
（一）雜交瘤細胞
1．親本細胞
（1）骨髓瘤細胞
SP2/0或其他適宜的骨髓瘤細胞系。應為不合成或不分泌免疫球蛋白鏈型，具有符合骨髓瘤細胞的染色體特征，并有明確的來源歷史及符合要求的保存條件。
（2）免疫親代細胞
經抗原免疫的鼠脾B淋巴細胞或外周血B淋巴細胞。
應有明確的免疫原來源、性質及動物種系，免疫原詳細的制備過程。
適宜的免疫方案及免疫淋巴細胞制備的方法。

2．細胞融合與克隆化
采用適宜的方法進行融合、篩選及克隆化。

3．雜交瘤細胞檢定
（1）抗體分泌穩定性
連續克隆化后抗體陽性率達100%，經體外連續傳代3個月以上和反復凍存、復蘇，細胞系能保持穩定分泌特異性抗體。
（2）細胞核學特征
檢查細胞分裂中期染色體，應符合雜交瘤細胞特征。

4．鼠源病毒檢查
按附錄要求檢測鼠源病毒。

5．支原體檢查
按現行《中國藥典》生物制品無菌試驗規程進行。

6．無菌試驗
按現行《中國藥典》生物制品無菌試驗規程進行。

（二）單克隆抗體的檢定
1．免疫球蛋白類及亞類
用免疫雙擴散法或其他適宜的方法測定。

2．親和力
用可靠、準確的方法測定單克隆抗體（以下簡稱為單抗）的親和常數或相對親和力。一般情況下，對于免疫原為可溶性的單抗，測其親和常數，對于免疫原為顆粒性抗原的單抗，測其相對親和力。

3．特異性
測定單抗對靶抗原的特異性；對多株單抗識別的抗原決定簇進行相關性分析。

4．交叉反應
按附錄要求。
免疫組織化學法測定單抗與人體組織交叉反應，用冰凍及石蠟包埋的各種正常臟器組織測定。來源于腫瘤相關抗原的單抗應進行與各種腫瘤組織的交叉反應試驗。

5．效價測定
用適宜方法測定。

（三）其他原材料
1．細胞培養用小牛血清
支原體檢測應為陰性。經小量試驗適于雜交瘤細胞生長。

2．培養液
應有培養液來源，質量指標。

3．化學試劑
規格應達到分析純以上。

二、基因工程抗體
參考《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》和本指導原則中的有關要求進行。

三、細胞庫的建立
應分別建立原始細胞庫、主細胞庫、工作細胞庫的三級管理細胞庫，一般情況下主細胞庫來自原始細胞庫、工作細胞庫來自主細胞庫。各級細胞庫應有詳細的制備過程、檢定情況及管理規定等。

四、單抗生產
包括用小鼠腹水法和細胞培養法制備。
（一）小鼠腹水法
1．小鼠
制備腹水必需使用合格的SPF級BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠雜交子一代。

2．動物實驗設施
動物實驗設施應有相關部門頒發的二級以上合格證。

3．腹水制備
取適量擴增培養的雜交瘤細胞注射小鼠腹腔制備腹水，小鼠可以預先用液體石蠟或降植烷等處理。

（二）細胞培養法
可以采用發酵罐培養，亦可用細胞培養瓶培養收集上清液制備單克隆抗體。培養基用無牛血清或低牛血清培養基，不能用-內酰胺類抗生素。

（三）抗體純化
可采用鹽析法、分子篩層析、離子交換親和層析等適宜的方法。
1．盡可能選用一些不引起免疫球蛋白聚合、變性等的純化方法及條件。

2．應驗證所用的純化方法能去除可能存在的非目標產物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生產腹水抗體的刺激物、內毒素、其它熱原質、培養液成分或層析柱析出成分等。

3．應驗證所用的純化方法能有效的去除/滅活病毒。

4．連續產生的各批產品必須符合質檢要求，批間具有良好的重復性。

5．純化后處理
必要時對純化后抗體采用適宜方法進行處理。

（四）半成品、成品制備

五、檢定
包括原液（小鼠腹水、細胞培養上清液、純化抗體）、半成品及成品的檢定等。
（一）物理化學檢測
1．外觀
液體制劑應為接近無色微帶乳光的澄清液體，不應含有異物、渾濁或搖不散的沉淀。

2．pH值
電位法測定

3．蛋白質含量的測定
用Lowry法或其它適宜的方法測定。

4．純度測定
（1）電泳法
用還原和非還原條件SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。掃描后免疫球蛋白含量應達到95%以上，二聚體≤10%。
（2）HPLC法
純度應≥95%。
（3）多聚體測定
用FPLC或HPLC法，用適宜的分子篩層析，多聚體應≤10%。

5．DNA含量測定
用DNA分子雜交法。每一劑量殘余鼠骨髓DNA含量不高于100pg。

6．水分
產品如為凍干制品，應進行殘余水分測定，其含量應≤3%。

（二）生物學檢定
1．活性及效價測定
用適宜方法進行。

2．鼠源病毒檢定
同上鼠源病毒檢查。

3．無菌試驗
同上無菌試驗。

4．支原體檢定
同上支原體檢定。

5．安全試驗
用小白鼠和豚鼠進行試驗。

6．熱原質試驗
按照現行版《中國藥典》生物制品熱原質試驗規程進行。采用家兔法時，家兔注射劑量=（人用劑量/50）*20*家兔體重（kg）。也可用鱟試劑法，1mg/mL蛋白濃度不應檢測出有凝集活性。

7．異常毒性實驗

（三）非免疫球蛋白雜質分析
包括來源于細胞基質、培養基和下游工藝的相關雜質，采用適當的技術和方法進行分析檢測。

六、經修飾的單克隆抗體
為了提高單克隆抗體在治療和體內診斷中的作用，常用單抗與毒素、藥物、放射性核素或其它物質偶連形成免疫結合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來獲得。研究者除對前面提到的有關未偶連單克隆抗體（未修飾單克隆抗體）的要求外，還應提供下列內容：

（一）免疫結合物的構建
應提供構建免疫結合物所用試劑和過程的詳細資料，包括：
1．描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥物、酶及細胞因子，包括：所有成分的來源、結構、制法、純度及特征。

2．制備免疫結合物所用化學試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應該包括試劑來源、制備方法，以及合成或純化時殘留雜質的測定等內容。還應提供合成反應途徑的圖解，以及與免疫結合物中所用化學試劑毒性相關資料。

3．在確定成品的標準時應首先確定該原料與抗體的平均結合率及每個抗體被結合部分的數量，并揭示免疫球蛋白置換數量、效力和穩定性間的關系。

4．用重組DNA技術制備的制品（如來源于轉染細胞系或微生物培養基，嵌合的、易形的，互補決定區［CDR］接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結合物）應提供構建和置備過程的全部資料。重組免疫結合物的穩定性應認真研究。因聚合物形成構形改變或變性而減弱了特異免疫反應性（如通過重組Fvs形成"雙抗"）可能導致藥代動力學的改變和/或與非靶組織結合。

（二）免疫結合物的純度
1．應采取特殊措施保證抗體盡可能無外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質在構建免疫結合物過程中，能與核素、毒素或藥物發生反應。

2．應規定最終產品中游離抗體或游離組分的限量�；钚灾虚g體應被滅活或去除。

（三）免疫結合物的免疫反應性，效力及穩定性
毒素或藥物偶聯至抗體上會改變其中任一成分的活性。
1．應采用適當的方法；評估偶聯前后的免疫反應性。

2．免疫結合物非免疫球蛋白成分的活性應在適當的時候用效力試驗來進行評估（例如，毒素、細胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結合物除外。

3．免疫結合物構建后，應確定免疫反應性變化的百分率限值，并作為產品規格的組成部分。

4．應通過在合并的人血清中37℃無菌條件下孵育，來檢測免疫結合物在體外的穩定性。假如所用抗凝劑不會影響免疫結合物的穩定性，血漿可以用來代替血清。經過規定間隔時間分析樣品中完整免疫結合物及分解產物的濃度。應詳細說明評估產品的穩定性的條件及所用陰、陽對照。

（四）與放射性核素偶聯單克隆抗體的特殊問題
放免結合物應用標準化的、嚴格控制并經過驗證的方法制備。應建立檢測游離同位素、結合單克隆抗體、標記的非免疫球蛋白物質的放射性百分率的方法。
1．放射性標記單克隆抗體的初始研究用新藥申報包含連續3次放射標記試生產的分析結果，應證明所制備的產品未改變免疫特異性、無菌、無熱原質。放射性標記試生產應由在研究中對單克隆抗體進行放射性標記及使用試劑的同一組人員進行。

2．制備免疫結合物時應使用放射性藥品及同位素并應提供其無菌及無熱原質的分析證書及橫向參比的信涵。

3．在標記試生產過程中，應測定最終產品中共價結合的和游離的同位素的濃度，以及標記試劑及其分解產物的殘留水平。

4．應描述給每一個病人應用前后進行的質控試驗。

5．適當的時候，應檢測免疫結合物形成膠體的情況，并對其進行限定。

6．有關單抗制備中放射性標記物的質控標準參考國家關于放射性藥品規定。

七、產品穩定性
產品穩定性應滿足臨床方案制定的要求。加速穩定性試驗資料可作為產品審批及標定用，但不能代替實際的穩定性資料。

（一）應制定穩定性檢定規劃，包括在規定效期全過程中，每間隔一定時間進行制品的物理化學完整性試驗（如斷裂或聚合），效力試驗，無菌試驗，以及水分、pH和防腐劑的穩定性測定。

（二）確保制品生物活性的穩定性試驗（例如定量體外效率試驗）應包括廠內參比品。如可能在試驗的全過程中只使用一批試驗抗原（如：純化的抗原、細胞或組織）。應用定量效力試驗使對生物活性進行有意義的比較成為可能。

（三）加速穩定性試驗，既將制品儲存在溫度高于常規儲存溫度后的穩定性試驗，可能有助于鑒定及建立穩定性指示試驗。表示穩定性的特定參數應通過對每一批制品用趨向分析方法進行監測。

八、臨床前研究
由于生產條件或配方的改變可引起制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應與臨床試驗中擬使用的單抗的生產工藝一致。

（一）交叉反應性試驗
當相同或相關抗原決定簇在人的非預定的細胞或靶組織表達時，可觀察到抗體與它們結合。非靶組織結合可能具有嚴重后果，特別是使用藥理活性抗體或細胞毒性免疫結合物時。因此，一般在Ⅰ期臨床試驗前應經過用人組織或細胞進行交叉反應性或非靶組織結合的實驗室檢測。對于雙特異性抗體，除檢測雙特異性產品外，還應對每株親本抗體進行逐個評估。

1．檢測交叉反應性的體外試驗
目前，用人細胞或組織進行免疫細胞化學及免疫組織化學技術檢測，應使用有效的并被確認的新技術（參照1．2．4）。

2．測定交叉反應性的體內試驗
當有適當模型時，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反應性應在動物中進行一次綜合的體內試驗。試驗結果，特別是對具有溶細胞性的免疫結合物或具有ADCC活性的抗體，通常要求進行更廣泛的臨床前試驗，包括用一種以上動物超劑量及重復劑量進行動物試驗。設計臨床試驗時應考慮對非靶組織的定位。

（二）臨床前藥理學和毒性試驗
1．設計單克隆抗體臨床前安全試驗是為了預測在人體中可能的毒性
評估在人體中潛在不良反應副作用的可能性和嚴重程度，并可能確定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關單克隆抗體的臨床前試驗，包括免疫原性、穩定性、組織交叉反應性和效應功能。

2．動物毒理學研究
當設計單克隆抗體的毒理學試驗時，應考慮如下：
（1）若被試樣品為未偶聯抗體，且無合適的動物模型或無攜帶相關抗原的動物，且與人組織交叉反應性試驗明顯陰性，則毒理學試驗不是必須的。

（2）動物體內相關抗原的性質與人體內相關抗原的生物學分布、功能及結構應具有可比性。但是，對于所用的動物模型，不必要求對單克隆抗體的抗原密度或親和力絕對相等。例如，結合力差異可通過增加劑量或服藥頻率來彌補。應鑒定動物和人之間存在的抗原數，單克隆抗體的抗原親和力或對單克隆抗體結合的細胞應答反應等方面存在的差異。這可以更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評估安全范圍。

（3）對單克隆抗體通常不要求進行常規誘變性的評估。

（4）擬給育齡婦女反復或長期使用的產品，應該用適當的動物模型進行反復的深入的研究包括致畸試驗。

3．藥效學和動物藥代動力學
（1）當有動物模型時，則應盡可能證明藥理學效應與劑量的依賴性，以及有效劑量的范圍，可以更好地預測治療指數；當無適合動物模型時，則應盡可能以人外周血、組織器官等進行體外藥效學研究。當有動物模型時，藥代動力學的有關資料（生物學分布，半衰期等）可以從動物模型中得到；當無適合動物模型時，動物藥代動力學可以考慮不做，加強臨床試驗時藥代動力學方面的監控。

（2）下列方面可以指導藥代動力學幾藥效學試驗動物種類的選擇：
①最好選擇與人有交叉反應或相同靶抗原的動物模型來進行試驗。對于僅抗人而未在動物模型中表達的人抗原或外源抗原（細菌，病毒等）的未偶聯單克隆抗體，可以不必用缺乏靶抗原的動物做試驗。
②當有抗原結合資料表明靈長類為最相關種屬時，則對未偶聯的單克隆抗體的試驗采用非人靈長類動物是適宜的。
③應對使用正常嚙齒類動物和鼠異源移植模型精確預測單克隆抗體在人體的藥代動力學行為的可能性進行嚴格評估。異源移植模型對評估單克隆抗體與人體內腫瘤結合的能力更有意義。

（3）鼠源抗體對于小鼠為非免疫原性物質，但在人體內具免疫原性，這就使得在鼠內所得的重復劑量結果難以推至擬在人體內使用的重復劑量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"單克隆抗體將出現相應的問題，在這種情況下用嚙齒類動物進行重復劑量的研究意義不大。

4．用免疫結合物進行的臨床體內研究
（1）應在體內試驗免疫結合物的穩定性
①應測定免疫結合物中每個組分在動物體內藥代動力學和組織分布，并且與未偶聯抗體的分布相比較。
②不同組分的靶組織和他們能引起的潛在的毒性應被證實。

（2）由于免疫結合物可能被降解或作用位點的活性不是單克隆抗體與靶抗原結合的結果，應對含有放射性核素、毒素或藥物的免疫結合物進行動物毒性實驗，盡管該種動物不存在靶抗原。根據免疫結合物組分的性質和其偶聯的穩定性，對組分分別進行試驗是有道理的。應充分描述每個組分的毒性情況、副反應的發生和嚴重程度。所得結果應與結合物穩定性試驗密切相關。如可能，應用具有相關靶抗原或疾病模型動物體內進行免疫結合物試驗，如果不存在靶抗原陽性動物就在嚙齒類動物體內進行。游離毒素或核素的毒性試驗可在不同類動物中進行。

（3）對于放射性核素的免疫結合物：
①動物生物分布的資料可被用于對初始人用劑量的評估。
②如可能，表達靶抗原的動物模型更有可能發現抗原"減少"或帶有在生物分布和/或毒性方面表現意外抗原的組織。
③異源移植模型可以組織定位和抗原非特異放射性免疫結合物分布問題，但對確定一般組織交叉反應范圍沒有幫助。
④應研究適宜的動物數量以用一個可接受的變異系數（通常小于20%）對放射性劑量進行評估。
⑤對于使用放射性總量的新陳代謝和測定從早到晚清除期時間點的適當數值應有完整計算。
⑥放射性免疫結合物應通過在血清或血漿中孵育檢測體外穩定性。應建立方法來評估游離表位，偶聯單克隆抗體，標記的非單克隆抗體三種中每成分存在的放射性百分比。
說明：對局部外用和制備體外診斷試劑盒單克隆抗體要求參照上述相關部分執行，但其生產條件、小鼠清潔級別、抗體純度和安全試驗可根據實際需要降低或減少要求。

附錄：鼠源性病毒檢測
1．被檢病毒
人用鼠源性單抗制品中可能含有潛在污染的病毒見下表。
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組 病毒 受影響動物
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Ⅱ 出血熱病毒 大鼠，小鼠
淋巴細胞脈絡從腦膜炎病毒（LCMV） 大鼠
3型呼腸孤病毒（REO） 大鼠，小鼠
大鼠輪狀病毒 大鼠
仙臺病毒 大鼠，小鼠
Ⅱ 脫腳病病毒 小鼠
KITHAM氏大鼠病毒（KRV） 大鼠
小鼠腺病毒（MAV） 小鼠
小鼠肺炎病毒（PVM） 小鼠
逆轉錄病毒 大鼠，小鼠
TOOLAN病毒（HI） 大鼠
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前五種病毒屬Ⅰ組，為能夠感染人與靈長類動物的病毒，后六種屬Ⅱ組，為目前尚無跡象表明感染人，但對人類具有潛在危險性，能在體外培養的人和猿、猴源性細胞中進行復制，這些病毒應作為重點進行檢測。

2．樣品
包括細胞株、腹水、動物血清、單抗半成品和成品等，用適宜方法預處理。

3．試驗方法
包括細胞試驗、動物抗體產生試驗、雞胚感染試驗等。
3．1細胞實驗
細胞及培養上清液分別接種人2BS、Vero細胞，培養，傳兩代后制片，用間接免疫熒光法檢測病毒抗原。
3．2動物抗體產生試驗
樣品接種出生24小時以內乳鼠10只（i．m）；15~20g成年小鼠20只（i．mti．p：10只接種樣品，10只作為對照）；小鼠20只（i．c：10只接種樣品，10只作為對照）。觀察4周存活率應在80%以上，用ELISA或其他適宜的方法檢測血清中病毒抗體。

3．3雞胚感染試驗
應用雞胚接種進行檢查，可用9~11天齡的雞胚，將樣品注射于10個雞胚的絨毛尿囊膜、尿囊腔及卵黃囊中。接種后雞胚至少在5天后才能進行檢查。并用豚鼠、雞或其它禽類的紅細胞檢查尿囊液中是否含有血凝素。

4．檢測范圍?
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樣品 細胞實驗 動物抗體產生試驗 雞胚感染試驗 備注
原始細胞庫 - 每批檢查
主細胞庫 - 每批檢查
工作細胞庫 - 每批檢查
鼠群 - - 定期抽查
腹水 - - 每批檢查
細胞培養法制備 每批檢查
單抗的上清液
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