SPA－ELISA技術(shù)原理

SPA 能天然地與人及某些哺乳動物的IgG分子上的Fc片段結(jié)合，一個分子的SPA可以同2個IgG分子以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合(這不是真正的免疫反應(yīng)，又稱為假免疫反應(yīng))，利用這個特性，以SPA代替IgG抗體而應(yīng)用于ELlSA中。

材料與試劑

1．SPA－HRP結(jié)合物,可向有關(guān)生物制品廠購買，也可自制，制法如下：

(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。

(2) 加入0.1ml用無水乙醇配制的1%的1－熒光－2，4二硝基苯，室溫(20℃)溫和攪拌1h。

(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室溫?cái)嚢?h。

(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液充分透析。

(5) 加入經(jīng)0.01mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液平衡的SPA 5mg/ml，于20℃溫和攪拌2h~3h。

(6) 加入5mg KBH4，混勻后，4℃放置3h。

(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析過夜。

(8) 過Sephadex G100柱(100cm×2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS液洗脫，流速10ml/h。

(9) 測OD403nm，集SPA－HRP活性部分。

(10) 將高活性組分合并，加入甘油(含30%)置低溫保存。也可以采用過碘酸鈉法，制法如下：①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；②加入無水乙醇配制1%1－熒光－2,4二硝基苯0.1ml，室溫混合1h；③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸餾水配制)室溫中混合30min；④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸餾水配制)，室溫緩慢混合1h；⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3緩沖液于4℃透析過夜；⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室溫緩慢混合3h即可。

(11) SPA－HRP活性測定：①取豬血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反應(yīng)板，4℃過夜，3×3min沖洗；②加入適量稀釋的SPA－HRP溶液0.1ml，置37℃2h，沖洗3×3min；③加入底物顯色，顯色的深淺應(yīng)與SPA－HRP的活性成正比。

2．稀釋液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。

3．包被液 pH9.6碳酸鹽緩沖液。

4．洗滌液 0.02Mol/L7.4Tris－HCl緩沖液。

5．底物溶液 pH 5.6磷酸鹽－檸檬酸緩沖液：

0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml

0.1mol/L 檸檬酸(19.20g/L) 24.30ml

H2O 50.00ml

用前加40mg鄰苯二胺,溶解后加30%H2O20.15ml。

6．終止液 2mol/L H2SO4 1滴。

操作方法

1．檢測抗體

⑴ 包被：用pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成50μg－100μg/ml，每孔加0.1ml，37℃感作2h后置4℃過夜。

⑵ 洗滌：以pH 7.4 Tris－HCl液洗滌3×3min。

⑶ 加樣：用pH 7.4PBS－Tween液稀釋被檢樣品，每孔0.1ml，37℃感作2h。

⑷ 洗滌3×3min。

⑸ 加SPA SPA經(jīng)pH7.4 PBS－Tween液稀釋后，每孔加入0.1ml，37℃30min。

⑹ 洗滌3×3min。

⑺ 加底物：每孔加底物0.1ml，置室溫15min(避光)，再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)終止反應(yīng)。

2．檢測抗原

⑴ 包被：以抗體包被,此抗體必須用SPA不能結(jié)合的那些動物的lgG,否則會因?yàn)镾PA同包被抗體結(jié)合而產(chǎn)生假陽性結(jié)果,包被條件同上。

⑵ 洗滌。

⑶ 加樣。

⑷ 洗滌。

⑸ 加抗體：此抗體必須選用能與SPA結(jié)合的動物IgG，否則可因?yàn)镾PA不能同此層抗體結(jié)合而發(fā)生假陰性結(jié)果。

⑹ 洗滌。

⑺ 加SPA。

⑻ 洗滌。

⑼ 加底物及終止反應(yīng)。

3．檢測培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原

⑴ 蓋玻片培養(yǎng)單層細(xì)胞。

⑵ 接種易感病毒。

⑶ 用甲醇固定細(xì)胞。

⑷ 加抗血清于蓋玻片上,37℃孵育1h。Tris－HCl液3×3min洗滌。

⑸ 將PPA滴加在蓋玻片上,37℃孵育30min。

⑹ 洗滌3×3min。

⑺ 將蓋玻片置底物溶液中,室溫15min。

⑻ 以pH7.4 Tris－HCl液稍加沖洗后即可鏡檢。

結(jié)果判定

1．檢測抗體或抗原

⑴ 眼觀判定：在對照組成立的前提下,和標(biāo)準(zhǔn)陽性孔相近顏色者,均判為陽性(＋)。

⑵ 酶標(biāo)儀測定：以空白對照孔調(diào)零，標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品校正至某一規(guī)定值，測定待測孔，當(dāng)待測孔OD值或計(jì)算值達(dá)某一規(guī)定閾值時(shí)，判為陽性。

2．檢測培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原 鏡下觀察，凡細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者，判為陽性。

注意事項(xiàng)

1．目前使用的聚苯乙烯塑料板對抗體的吸附性能較好,，因此對于抗原，特別是大分子(分子量＞100萬)的抗原應(yīng)該進(jìn)行一些適當(dāng)?shù)奶幚?如DNA,應(yīng)將其事先凍融，使其變成較小分子再包被，如脂蛋白則應(yīng)改變包被的溫度，可在37℃包被過夜。

2．由于SPA－ELISA的敏感性極高，因此也很容易出現(xiàn)非特異性顯色,排除非特異性顯色的方法除了純化抗原抗體外，還應(yīng)該注意：

⑴抗原包被后，再以牛血清白蛋白包被一次或稀釋液中加入1%的牛血清白蛋白均可，以占據(jù)未包被的一些空隙。

⑵檢測血清抗體時(shí)，需事先檢測大標(biāo)本量的正常血清效價(jià)水平，在檢測待檢標(biāo)本時(shí)，減去正常的血清效價(jià)。

⑶ELISA法加入標(biāo)記物后往往37℃孵育2h，SPA同IgG的結(jié)合不是免疫反應(yīng)，而是一種化學(xué)反應(yīng)，一般認(rèn)為，這種結(jié)合可能在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生,所以加PPA后，孵育時(shí)間可以縮短到0.5h。孵育過久，反而可因?yàn)镾PA本身吸附到反應(yīng)板上，造成非特異性顯色。

3．疊氮鈉對SPA顯色影響較大，所以在SPA-ELISA過程中，不宜加疊氮鈉做防腐劑，在組織細(xì)胞培養(yǎng)固定，也不適宜用甲醛固定，而需采取甲醇或乙醇。