二步法：EnVision System
EnVision顯色系統是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯接成一個多聚體（即
EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點：敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。
EnVision工作程序：
1） 脫蠟、水化組織切片。
2） 預處理組織切片（據一抗具體說明而定）
3） 蒸餾水漂洗，置于TBS中。
4） 阻斷內源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTM/HRP）
5） 蒸餾水漂洗，置于TBS，10分鐘
6） 一抗孵育10-30分鐘
7） TBS漂洗10分鐘
8） EnVisionTM孵育10-30分鐘
9） TBS漂洗10分鐘
10) 色源底物溶液孵育10分鐘
11) 蒸餾水漂洗
12) 復染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
• 抗原抗體反應
• 標記化學反應
• 呈色化學反應
要求
待檢標本形態結構
和抗原性保存良好,
抗原不從原位擴散
或丟失
Specimen preparation
取材新鮮，固定及時，形態保存完好，抗原物質的抗原性不丟失、不擴散和被破壞
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
減少或消除非特異性染色的方法
• 最常見原因 蛋白吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上
• 最有效方法
1. 在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，
2. 加入2-5%牛血清白蛋白可進一步減少非特異性染色，
3. 用除制備第一抗體以外的其它動物血清（非免疫的）
對照實驗
主要是針對第一抗體對照，常用方法：
• 陽性對照：已知陽性
• 陰性對照：
1.已知陰性
2.空白對照 BS代替特異性抗體
3.替代對照:用同種屬正常血清代替特異性抗體
4.吸收實驗:先用抗原吸收一抗
5.抑制實驗:先用未標記抗體,再用標記抗體
6.置換實驗:用無關的特異性抗體代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
1. Fluorescence
2. Enzyme-Mediated Detection
3. 親和組織化學（Affinity histochemistry）
1. Fluorescence
Directly Indirectly
直接法 間接法
補體法
雙標法
使用熒光顯微鏡的注意事項
• 暗室
• 點燃汞燈5-15min,穩定后再開始觀察
• 光源壽命有限,應集中觀察,防止反復點燃,燈熄后應充分冷卻才能再次點燃,一次觀察時間不能太長,以2-3h內為宜
• 標本染色后應盡快觀察,存放在4C能延緩熒光衰減,標本不能長時間暴露于紫外線
熒光顯微鏡標本制作要求
1.載玻片:厚度均勻,0.8-1.2mm之間,光潔,無自發熒光
2.蓋玻片:厚度0.17mm,光潔
3.標本:不能太厚
4.封裱劑:無自發熒光,無色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸鹽緩沖液等量混合
5.鏡油:無熒光鏡油,或甘油或液體石蠟
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
間接法 (Indirect)
基本原理
• 以間接法法為例
• 一抗是對組織細胞內某種抗原的特異性抗體（80-90%多抗由家兔制得，單抗由小鼠制備）
• 二抗為一抗（IgG）的抗體。
• 優點：只要一抗來自同一種屬，同一標記的二抗就能用來顯示不同的抗原，避免了直接法標記每一種一抗，提高了敏感度。
酶標抗體法的特點
• 用于標記的酶應具備以下幾點:
1.酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，易于光、電鏡觀察
2.所形成的終產物必須穩定,不能彌散
3.較易獲得,價廉,最好已商品化
4.組織中不應存在內源性酶或類似物質
5.酶應穩定,標記后保持酶和抗體的活性
缺點 酶與抗體共價結合損害部分抗體和酶的活性
三步法(HRP labelled)
多層反應法
Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique
過氧化物酶抗過氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)
• 原理與酶橋法相似
• 制備PAP復合物: 使抗HRP抗體與HRP形成可溶性復合物
PAP復合物的特征
• 在抗原稍過量時,所有抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復合物
• PAP復合物的形狀相當穩定,不受抗原量的影響
• PAP復合物中HRP/抗HRP抗體的比例為3:2,即由3個HRP分子與2個抗HRP抗體組成,呈五角形結構
PAP法的評價
• 抗體活性高:非標記抗體酶法最大限度地保存了抗體活性
• 靈敏度高:3個酶分子對應1個抗原
• 不適合免疫電鏡 AP復合物分子量大
• 背景染色低
假陰性及其處理
假陽性及其處理
1.組織細胞內色素: 如神經黑色素,可用AKP代替HRP
2.假過氧化物酶活性: 如RBC內的血紅素輔基,用甲醇-0.3%H2O2預處理15-20min(室溫)
3.內源性過氧化物酶活性: 如粒細胞、巨噬細胞等，用AKP代替HRP
4.游離醛基: 與蛋白質(含IgG)非特異性結合,用白蛋白預孵育封閉之
5.疏水鍵和離子鍵: Ig可通過疏水鍵和離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體非特異性結合,用正常血清(首選制備二抗的種屬)于一抗前孵育封閉之
6.天然抗體及不純抗體: 增加一抗稀釋度
7.載體蛋白抗體: 制備半抗原的抗體時,使用了載體蛋白,用固相吸收技術將載體蛋白抗體除去
增加染色強度方法
1.重復顯色
2.重復一抗
3.雙橋PAP法
親和組織化學（Affinity histochemistry）
• 新技術的出現----新進展
• 特點 一些具有雙價或多價結合力的物質如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被應用于ICC，其共同特點是以一種物質對某種組織成分具有高親和力為基礎。它們既有別于古老的組織化學的分解、置換、氧化和還原，本質上又非抗原抗體反應。稱為親和組織化學（Affinity histochemistry）。廣義的親和組織化學包括：
抗原與抗體、植物凝集素與糖類、生物素與抗生物素、 SPA與IgG、陽離子與陰離子、配體與受體等。
• Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers
生物素-抗生物素基本原理
• Avidin 卵白素，統稱為抗生物素或親和素 a basic glycoprotein，MW 68 Kd
• biotin 生物素，small water soluble vitamin （vitamin H），MW 24Kd，
• Avidin(卵白素)具有4個同biotin(生物素)親和力極高（較抗原抗體高100萬倍）的結合點。能夠彼此牢固結合而不影響彼此的生物學活性。同時它們都具有與其它示蹤劑結合的能力。
抗生物素-生物素-過氧化酶復合物技術(Avidin Biotin-Peroxidase Complex technique,ABC技術)
ABC法的評價
advantages
1.敏感性強:親和力強
2.特異性強:一抗和二抗工作濃度低
3.時間縮短
4.多重標記
注意事項
1.內源性生物素活性:如肝、腎、白細胞、脂肪組織和乳腺，預先用0.01%的抗生物素和0.01%生物素分別作用20min，每次作用后PBS5minX3次
2.差異大,注意廠家、批號
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP約為10, 中性pH時帶正電荷,容易與nucleus等帶負電荷結構非特異結合.
2.Avidin是glycoprotein, 與lectins等分子通過碳水化合物連接
• 通過用streptavidin(抗生蛋白鏈霉素) 代替avidin克服上述缺陷.
• Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(鏈霉親生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH時很少帶電荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins.
橋抗生物素-生物素技術(Bridged Avidin-Biotin technique, BRAB技術)
標記生物素-抗生物素技術(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技術)