(一)原理 IRMA是采用過量的標記抗體與待測抗原的非競爭性結合反應,然后加入固相的抗原吸附劑以結合游離的標記抗體,離心去沉淀,測定上清液中的放射性強度,從而推算出待測樣品的抗原含量。
(二)放射免疫檢測與免疫放射檢測(即IRMA與RIA)的區(qū)別
見表13-4。
表13-4 IRMA與RIA的區(qū)別
IRMA
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RIA
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標記物質
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抗體
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抗原
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標記物用量
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過量
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限量
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反應方式
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直接結合
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競爭性結合
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B、F分離方式
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固相抗原免疫吸附劑
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第二抗體等
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(三)標記抗體的制備
特異性抗體的制備,質量要求及125I標記方法與RIA基本相同。抗體IgG分子中含有多個氨基酸殘基,經過碘化反應后,不影響其免疫學活性,并能結合上較多的碘原子,標記物的比放性高,克服了RIA中某些抗原不易標記,或在標記過程中容易發(fā)生化學或放射性損傷等缺點。同時純化的抗體比抗原的純品來源更為豐富。標記抗體的方法比較單一,也易于掌握,不同于標記抗原,每一種抗原必須標記一次,且抗原復雜,多種多樣,標記方法也多種多樣。如果將抗體分子酶解成Fab片段,形成單價抗體,再進行標記,這樣其敏感性將顯著高于一般的IRMA。
(四)免疫吸附劑的制備
免疫吸附劑是將高純度的抗原連接在固相載體上而制成。所用固相載體要求對抗原的結合力強,對非特異性蛋白質的吸附性能低,且具有高度的分散性,這樣才能大量地結合特異性抗體。一般采用重氮化的纖維素、溴化氰化的纖維素、瓊脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠和玻璃粉等作為抗原吸附劑的固相載體。
近年來發(fā)展建立的雙抗體夾心IRMA法,用固相抗體代替抗原免疫吸附劑,反應后形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物,經過洗滌即可除去游離的剩余標記抗體,簡化了分離步驟,并保證了較高的特異性。
固相抗體的制備方法有兩種:一種是物理吸附法,將塑料小珠浸泡在稀釋的抗體中,用前經過洗滌即可。或者將抗體吸附在塑料試管中;另一種是采用化學連接法,將抗體較牢固的結合,這樣洗滌時不易脫落,塑料小珠浸泡的條件是50mMol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液,抗體的濃度為IgG 0.1μg/ml~100μg/ml。塑料試管吸附抗體的條件是抗體濃度0.1μg/ml~100μg/ml 37℃、4h~6h或4℃ 24h。
(四)測定方法
根據試驗設計的特點,可分為以下幾種類型。
1.直接IRMA法 將待測抗原與過量的標記抗體進行溫育,使二者結合。然后加入固相抗原免疫吸附劑再次溫育,吸附游離的標記抗體。離心去除沉淀物,測定上清液中放射性強度。根據標準曲線即可得知待測樣品中的抗原含量。
2.雙抗體夾心IRMA法 在待測抗原內依次加入固相抗體(或將待測品直接加入抗體包被管內)和標記抗體,反應后形成固相抗體(Abl)-抗原-標記抗體(Ab2)復合物。洗滌除去未結合的游離標記抗體。測定固相抗體或載體上免疫復合物的放射活性,根據標準曲線求得待測得抗原量。此法僅適用于檢測有多個抗原決定簇的多肽和蛋白質抗原。
3.間接IRMA法 此法是在上述雙抗體夾心法的基礎上,進一步改良為125I標記Ab2的抗體,反應形成的固相抗體(Ab1)-抗原-Ab2-標記抗體(﹡Ab3)的四重免疫復合物。其中標記抗體(﹡Ab3)可做為通用試劑,由于同種Ab2的各種IRMA,省去了標記針對不同抗原的特異性抗體。
4.BAS-IRMA法 是將生物素-親和素系統(tǒng)引入免疫放射分析,建立了新一代IRMA。此法的最大優(yōu)點是使用生物素的抗體和以125I標記親和素為示蹤劑,可以通用于甾體類、甲狀腺素、前列腺素等多種分子物質的檢測。固相半抗原結合物經過無水乙醇處理,結合非常牢固,可長期保存;反應和測定在同一試管內完成,操作十分簡便,適用于IRMA技術自動化檢測。