直接培養法
· 原理：直接培養支原體于培養基中，觀察其生長及菌落生成。
· 特點：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
· 缺點：培養時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組，可能會造成污染。
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。）
· 培養基制備：基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養基中以防止其它細菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
· 液體培養基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個月。
· 固體培養基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存于4℃，期限1個月。
步驟：
· 取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養基中，置于37℃培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。
· 另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。
· 另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。
結果判讀：
· 支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養1~2周增殖后，再培養于agar plate上。需至少培養3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。
· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態（slime）。
· 若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養于液體培養基中，培養一星期后再種入agar plate，若是細胞則不會生長。

DNA熒光染色法
· 原理︰利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。
· 測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種于指示細胞培養液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養指示細胞再作熒光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。
· 待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養后直接作熒光染色。有些細胞易有熒光背景，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。
· 特點︰簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養法快，約一星期即可知道結果。
· 缺點：有時仍會有熒光背景，影響判讀。
材料︰
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細胞須先測試無污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell)
配制試劑:
· 無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
· 培養Vero細胞： Vero細胞可作長期培養或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。
· 在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。
· 接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養基，1ml待測細胞培養液（可將細胞稍微刮下），0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。
· 將測試樣品加入chamber slide內，培養5天后，進行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養液或冷凍細胞液），負反應對照組為Vero cell之新鮮培養基( αMEM 10鸖)。
DNA熒光染色檢測︰
· 取出培養5日之Vero細胞，吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。
· 于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
· 以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色熒光小點或是絲狀點之熒光物產生。
結果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色熒光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其熒光可維持數星期。