高MOI（ Multiplicity Of Infection，等于用于感染的病毒數目與細胞數目的比值）感染是生產蛋白的最好方法。這有兩個原因。一是不用考慮DIP（Defective Interfering Particles，即只包裝入部分基因組的病毒顆粒）的形成，因為關心的是細胞或者培養液中的蛋白；二是高MOI感染是最便于控制、重復性好的方法，以達到高的蛋白表達水平。

低MOI感染也可用于生產蛋白，但是難以控制，難以達到最高的表達量。然而病毒需要量少的確是該法的一個優點，對于大規模的生產這個優點極為有利，只要它們可以可靠的復制，這因不同的重組病毒而異。

一般說來，用高MOI感染的方法就是將培養液中所有的細胞同時感染，每個細胞至少感染一個病毒顆粒。這個過程的幾率可以用Poisson分布來分析，簡而言之，如果你想同時把所有的細胞都感染，MOI值應該接近3。由于一旦加入病毒細胞就不再生長，因此你可以精確的控制感染時細胞的密度，這個密度大約應該大約是平臺期最大密度的一半。隨著細胞株的不同，大約在1.5~2.5×106細胞/ml之間。

重要的是培養液的量要滿足細胞生長的需要，否則將沒有足夠的營養使細胞生產病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在細胞增殖到合適密度并用掉所有營養資源之前就被殺死。用高MOI感染的方法，這些條件比較容易優化，只需準備密度變化在1~3×106細胞/ml之間的一系列細胞培養物，以固定的細胞：病毒比例去感染細胞，篩選蛋白產量最高時的那個密度即可。

采用這個方法需要你使用足夠量的病毒使細胞生長立即停止。病毒量可以通過進行一個小量實驗來確定，先使細胞達到上面確定的最優密度，然后變化病毒的量確定感染率。高MOI感染的最大的缺點是需要準備大量的高滴度病毒，這個缺點在大量生產時尤為突出。例如，如果你的病毒不能形成高滴度的溶液，只能達到3×107pfu/ml左右，你需要加相當于細胞培養物20%體積的病毒。如果細胞的密度為2.5×106，體積為8升，那么為了得到密度為2×106細胞/ml的被感染細胞，需要加入2升病毒！你的細胞必須能夠生長到較高的密度--2×106細胞/ml，并且保持對數期良好狀態，你必須加入相當于終體積20%的培養液以達到最終體積，這是實驗能夠順利進行下去的極限。

然而，如果你可以得到高滴度的病毒以滿足感染的需要，這種方法的產量、可重復性非常高。因此，我建議在表達一個新的蛋白時，開始最好先試用這種方法。并且用這種方法得到的蛋白的產量可作為衡量其它方法（低MOI感染）產量的標準。尤其是當你的培養物體積小時（小于500ml），這是最好的方法。

步驟

將你的細胞以2~8×105細胞/ml的密度分裝到搖瓶或者攪拌器中，達到搖瓶體積的20~40%，記得留出一些空間以待于將來加病毒。當培養物的體積小于500ml時，我更喜歡用搖瓶。在27±2℃培養，轉速為100~130rpm。

第0天

培養細胞至密度達到大約1.5~2.5×106細胞/ml，即最大密度的一半。這可能需要多于1天的時間，與接種密度有關。

加入足夠的病毒，以使所有的細胞被同時感染，但是避免加入的病毒體積多于終體積20%，最好不要多于10%。加入的量取決于病毒的滴度。

如果細胞的密度為2×106細胞/ml，病毒的滴度為5×107pfu/ml，要達到MOI值為3，需要加入12%體積的病毒。

將搖瓶放回27℃搖床，培養24小時。

感染后第1天

計數細胞，估計細胞大小。如果是在高MOI下感染，那么所有的細胞都已經被感染。它們與第0天比將不會在數目上增長，并且在細胞形態上顯著膨脹。此時很容易看到細胞表面變得粗糙，這是病毒正在出芽的結果。

如果發現細胞數目有所增多，可能是由于對病毒滴度的估計偏高，使得細胞沒有全部被病毒感染。這種現象在MOI值大于3時很少出現，因為一般的桿病毒噬菌斑實驗結果通常是低估病毒的滴度。如果細胞數目的增長沒有超過25%，可能只會影響最佳收獲時間。平均每個細胞生產的蛋白量也會稍低。

感染后第2天

再次計數細胞，估計細胞大小。此時與第1天比細胞數目無論如何都不應該再增長。如果增長了，你的感染可能分布不均勻，很可能是病毒滴度低造成的。

此時細胞應該大大膨脹，細胞核占據了細胞的大部分空間。

此時可能是細胞或者培養液的時間了，這因不同的蛋白而異。大多數蛋白的產量在感染后48~72小時之間不會再有增長。不過這需要實驗來確定。

感染后第3天

再次計數細胞，估計細胞大小。此時所有的細胞應該已經被徹底感染，細胞膨脹并且生長停止，否則就說明沒有足夠的病毒使細胞在達到平臺期之前停止增長。收獲培養物，離心分離細胞，將培養液避光保存于4℃，或者凍存于-70℃。

通常最好將細胞沉淀凍存。我喜歡的方法是將細胞重懸于小量（比如1/4體積）的PBS或者TBS（含有濃度為通常5倍的蛋白酶抑制劑）中，充分重懸后直接用微量移液器加入充滿液氮的干凈Dewar瓶中。滴下的重懸物遇到液氮迅速凍結形成小球，這些小球可以被分裝到50ml圓錐管中，凍存于Revco冰箱中。當需要從細胞中純化蛋白時，只需將這些小球逐個加入到3~5倍體積室溫下不斷攪拌的裂解緩沖液中，它們將很快融化，使緩沖液降至接近0℃。這些小球還可以用鑷子方便的轉移到eppendorf管中作小量實驗。