基本原理：

在長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況，會(huì)導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細(xì)胞系的丟失。為防止這些細(xì)胞的丟失，細(xì)胞可以經(jīng)快速冷凍并幾乎無(wú)限期保存在非常低的溫度下，如液氮（-176℃）。

試劑和設(shè)備：

冷凍液: 90%滅活血清 10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存；
培養(yǎng)液；
臺(tái)盼藍(lán)溶液（0.4%溶解于PBS）；
70%乙醇；
組織培養(yǎng)瓶；
15-50 ml 無(wú)菌圓錐底離心試管；
離心機(jī)；
血球計(jì)數(shù)板；
超凈工作臺(tái)；
光學(xué)顯微鏡；
37℃水浴；
冷凍管；
-80℃冰箱；
液氮和液氮容器。
操作步驟：

（一）冷凍細(xì)胞

1．收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；

2．以25μl臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25μl細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（至少應(yīng)該在90%以上）；

3．細(xì)胞懸液在4℃ 條件下200´g離心10分鐘；

4．將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5´106細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液）；

5．將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；

6．將冷凍管置于-80℃冰箱中；

7．24小時(shí)后，將冷凍管移入液氮罐中；

8．在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1．將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時(shí)攪拌加速解凍；

2．當(dāng)細(xì)胞完全解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；

3．將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中；

4．細(xì)胞懸液在4℃下200´g離心10分鐘；

5．棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中；

6．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱中培養(yǎng)；

7．是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密度，如果細(xì)胞密度過(guò)高，用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。

對(duì)照試驗(yàn)

在冷凍細(xì)胞被移入到液氮罐中一段時(shí)間后，取出一管細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng)以檢測(cè)存活率。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明：

1．嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則（即戴上合適的手套和護(hù)目鏡），液態(tài)氮對(duì)眼睛極為有害；

2．對(duì)一瓶細(xì)胞培養(yǎng)液要盡可能多分裝幾個(gè)冷凍管；

3．延長(zhǎng)暴露在DMSO中的時(shí)間對(duì)細(xì)胞有害，因此冷凍和解凍操作要盡可能快；

4．細(xì)胞可以暫時(shí)穩(wěn)定保存在-80 ℃達(dá)數(shù)月；

5．每批次冷凍和復(fù)蘇的細(xì)胞的存活率可能會(huì)不相同，為避免這個(gè)問(wèn)題，每次細(xì)胞凍存最好分兩批以上進(jìn)行；

6．DMSO可以防止在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)冰結(jié)晶，凍存過(guò)程需要逐步降低溫度；

7．如果復(fù)蘇后細(xì)胞難以恢復(fù)到良好狀態(tài)，可以使用含10%鼠胚胎成纖維母細(xì)胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液以促進(jìn)恢復(fù)；

8．也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養(yǎng)液為冷凍液。