�。�1）組織準備：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 體重），或1%戊巴比妥鈉約1ml（3～4mg/100g體重）腹腔內注射麻醉，用100ml生理鹽水沖洗和150ml 4%多聚甲醛主動脈灌注固定。固定半小時后?〕鱟櫓?椋?萌?%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。
　　如要取腦組織，可于灌注后置4℃冰箱內過夜，次晨取腦組織，后固定4℃4h左右。
　　（2）組織切片/培養(yǎng)細胞在經過處理，抹以粘附劑的載片上，在43℃烤箱過夜。
　�。�3）在PBS（0.1mol/l Ph7.2）中浸5～10min。
　　（4）浸于0.1mol/L甘氨酸—PBs 液內5min。
　�。�5）為增強組織通透性，將載片置于0.3%Triton X-100(在PBS內)10～15min。
　�。�6）PBS洗3×5min。
　�。�7）在蛋白激酶K（1μg/ml）溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8）中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
　�。�8）浸入新鮮配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2）3min以終止消化作用和再固定。
　�。�9）浸入新鮮配制的含0.25%（V/V）三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0）中，10min以達乙�；�（acetylate）的目的。
　　（10）預雜交：在50%（V/V）甲酰胺溶于4×SSC預熱37℃15～45min 。
　�。�11）雜交：將載片上過量的甲酰胺液傾去，加20μl雜交混合液（含放射性同位素標記的探針量為5×103～106cpm/每張載片）。覆以硅化的蓋玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒內以保持濕度，42℃孵育12～18h。為使載片不致于浸泡于SSC溶液內，通常以二根玻管（或棒）扎成擔架狀，載片置于玻棒上，與鹽液不接觸，但可保持盒內空氣濕潤。
　�。�12）雜交后漂洗
　　①以小燒杯盛適量4×SSC溶液，將載片一端斜插入溶液內，輕輕抖動以移除蓋玻片。
　　②將載片置于有刻度的染色用小方玻缸內，加入42℃（預熱）4×SSC，3×20min。在漂洗過程中宜不斷振動，以增強漂洗效果。如設有調整鈕的振動臺更為理想。
　　③加20μlRNA酶溶液（20μg/ml）在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0）消化未雜交探針，42℃30min（也有不加EDTA的）。
　　④以遞減梯度鹽溶液SSC漂洗載片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
　�、萏荻染凭�脫水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室溫，每次10min，空氣干燥后待進行放射自顯影。
　�。�13）放射自顯影和復染
　�、僭诎凳抑蓄A熱水浴至45℃，將分裝的核乳膠溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同時預熱一電熱板至45℃。將雜交后漂洗過完全干燥的載片依次排列于玻片架上，有組織切片一面面向實驗者。在實驗的載玻片前放1～2張無切片的干凈玻片，作為測定核乳膠溶解度與浸片高度等的空白對照片。浸泡（Dipping）過核乳膠膜的載片放入暗盒內，事先最好將暗盒準備好，為保持干燥，放入一包變色硅膠干燥劑（無水干燥劑為小塊藍色晶體，吸水后呈粉紅色，置烤箱中烘干待轉成藍色后可重復應用），預先備好封固暗盒用的膠帶備用。
　　②核乳膠液，國外產品為ILFord K5乳膠液，國內核乳膠產品可自原子能研究所訂購。不論國產或進口乳膠，事先應（按說明需要濃度）稀釋分裝在10ml小瓶內，密封于暗盒內，4℃?zhèn)溆�。反復的冷凍和融解核乳膠會增加背景染色。每一小瓶供一次性實驗應用。
　　為節(jié)省核乳膠，切片宜貼附在靠近載片的一端。這樣，在浸泡時少量乳膠便可充分覆蓋切片。
　�、劢�核乳膠（Dipping）：當一切準備工作就緒后，在暗室中（只留完全燈）先將載片置于電熱板上預熱1～2min。以空白載片浸入核乳膠液，取出后檢查核乳膠是否充分溶解，玻片上有無氣泡。然后正式進行切片浸入。浸核乳膠膜是一項需反復操練的技術。以拇、食指夾住玻片一端，以垂直方向進入乳膠，進入的提出均應采取中速度，且速度應保持穩(wěn)定，提出后可將玻片一端滴下的乳膠輕沾于吸水紙上，掌握好該技術，浸入形成的核乳膠膜厚度適當，均勻一致。依序放在預熱45℃的電熱板，傾斜度應一致。在45℃電熱板上干燥至少1～2h，在此期間應嚴格控制在黑暗中。
　�、苎b入暗盒曝光：將載片架上已干燥覆有核乳膠的載片放入暗盒內，周圍用膠帶封固，以標簽寫明：樣品種類，實驗者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱內。曝光時間依同位素種類而異，32P大約需5～7日，3H需4周，但還要參考細胞內mRNA的含量而定，含量高者曝光時間宜短，反之宜適當延長。可根據不同曝光時間的實驗結果予以調整。曝光時間長可增加信號，但也增加背景，反之，信號減弱，但背景亦低。
　�、蒿@影：取出切片中暗盒（注意：切勿啟封），放在室溫至少1h，使其回升到室溫。然后在暗室內（只留安全燈），將載片置入Kodax D19顯影液（預調溫至18～20℃）3min。水沖片刻后入Kodax F24固定劑內3min。上述溶液及水溫最好都保持在18～20℃。突然改變溶液溫度會損壞精細的核乳膠膜。另外，在顯影和定影過程中不要振蕩溶液，因為，這時的乳膠還是處于膠狀結構，溶液振蕩的沖擊可使乳膠膜產生劃痕。
　　⑥沖洗，脫水和復染：用自來水（水沖力勿過猛）沖洗載片20min，如需要可用1%蘇木精復染，復染后自來水沖洗分化2min，梯度酒精脫水（70%，90%，100%）每次3min，二甲苯透明，DPX封片。