一、原理
將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養。
二、儀器、材料及試劑
儀器:培養箱(調整至37℃),培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱(37℃)
材料:胎鼠或新生鼠
試劑:1640培養基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液,碘酒
三、操作步驟
(一)胰酶消化法
1、器材:將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2—3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(或將新生小鼠在超凈臺內)解剖取肝臟,置平皿中。
2、用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
3、用手術剪將肝臟剪成小塊(1mm2),再用Hank’s液洗三次,轉移至小青霉素瓶中。
4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
5、加入3—5ml培養液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
6、靜置5—10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm,離心10分鐘,棄上清液。
8、加入Hank’s液5ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
9、加入培養液l—2 ml(視細胞量),血球計數板計數。
10、將細胞調整到5×105/ml左右,轉移至25ml細胞培養瓶中,37℃下培養。
上述消化分離的方法是最基本的方法,在該方法的基礎上,可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同,所采用的消化酶也不相同(如膠原酶,透明質酶等)。
(二)組織塊直接培養法
自上方法第3步后,將組織塊轉移到培養瓶,貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上,將培養液加至瓶中,培養液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時,輕輕翻轉培養瓶,使組織浸入培養液中(勿使組織漂起),37℃繼續培養。
四、注意事項
1、自取材開始,保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2、在超凈臺中,組織細胞、培養液等不能暴露過久,以免溶液蒸發。
3、凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細菌落入。
五、無菌操作的幾個注意事項
1、操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2、點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3、操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
附:Hank’s液配方:
KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4•H2O 0.06g,加H2O至 1000ml
注:Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。
將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養。
二、儀器、材料及試劑
儀器:培養箱(調整至37℃),培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱(37℃)
材料:胎鼠或新生鼠
試劑:1640培養基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液,碘酒
三、操作步驟
(一)胰酶消化法
1、器材:將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2—3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(或將新生小鼠在超凈臺內)解剖取肝臟,置平皿中。
2、用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
3、用手術剪將肝臟剪成小塊(1mm2),再用Hank’s液洗三次,轉移至小青霉素瓶中。
4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
5、加入3—5ml培養液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
6、靜置5—10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm,離心10分鐘,棄上清液。
8、加入Hank’s液5ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
9、加入培養液l—2 ml(視細胞量),血球計數板計數。
10、將細胞調整到5×105/ml左右,轉移至25ml細胞培養瓶中,37℃下培養。
上述消化分離的方法是最基本的方法,在該方法的基礎上,可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同,所采用的消化酶也不相同(如膠原酶,透明質酶等)。
(二)組織塊直接培養法
自上方法第3步后,將組織塊轉移到培養瓶,貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上,將培養液加至瓶中,培養液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時,輕輕翻轉培養瓶,使組織浸入培養液中(勿使組織漂起),37℃繼續培養。
四、注意事項
1、自取材開始,保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2、在超凈臺中,組織細胞、培養液等不能暴露過久,以免溶液蒸發。
3、凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細菌落入。
五、無菌操作的幾個注意事項
1、操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2、點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3、操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
附:Hank’s液配方:
KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4•H2O 0.06g,加H2O至 1000ml
注:Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。