5.1. 微生物菌種保藏
在發酵工業中，具有良好性狀的生產菌種的獲得十分不容易，如何利用優良的微生物菌種保藏技術，使菌種經長期保藏后不但存活健在，而且保證高產突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力，即很少發生突變，這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術很多，但原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環境中。具體常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜面傳代保藏；干燥-載體保藏或冷凍干燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面傳代保藏
斜面傳代保藏方法是將菌種定期在新鮮瓊脂斜面培養基上、液體培養基中或穿刺培養，然后在低溫條件下保存。它可用于實驗室中各類微生物的保藏，此法簡單易行，且不要求任何特殊的設備。但此方法易發生培養基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現象。因此要求最好在基本培養基上傳代，目的是能淘汰突變株，同時轉接菌量應保持較低水平。斜面培養物應在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業生產菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養物或穿刺培養物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏，操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養基上生長，然后注入經160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養物1cm為宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗，因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源，還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏，為了預防不測，一般保藏菌株 2~3年也應做一次存活試驗。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當的載體上，如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，制備方法為：將河砂經24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機物，用水漂洗至中性，烘干，然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經真空干燥8 h，于常溫或低溫下保藏均可，保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經風干、粉碎，然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了保藏的結果更加令人滿意，通常在培養物中加入一定的冷凍保護劑；同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養物運輸較困難。
普通冷凍保藏技術(-20℃)：將菌種培養在小的試管或培養瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養物或從瓊脂斜面培養物收獲的細胞分別接到試管或指管內，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應注意的是經過一次解凍的菌株培養物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術：近年來，大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，并發現在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發生率極低。液氮保藏巳成為工業微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養基上培養好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30℃)。待細胞凍結后，將致冷速度降為1℃／min，直到溫度達到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養到最大穩定期后，一般培養放線菌和絲狀真菌約需7~10天，培養細菌約需24~28小時，培養酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為109~1019個/ml，取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養物干燥。最后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規方法保藏的動植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發展，越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它們的載體質粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩定、且其外源質粒復制子很容易丟失。另外，對于宿主細胞質粒基因通常為生長非必需，一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。而由質粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質粒的細胞群體時極為有用。當培養基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協調。由此看來基因工程菌最好應保藏在含低濃度選擇劑的培養基中。例如，質粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養基中加入Amp和Tet，則培養時可選擇出含pBR322質粒的細胞。
5.1.9. 菌種保藏機構
1979年7月，我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM),委托中國科學院負責全國菌種保藏管理業務,并確定了與普通、農業、工業、醫學、抗生素和獸醫等微生物學有關的六個菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應用微生物各學科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經濟建設、科學研究和教育事業服務。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統:
中國微生物菌種保藏管理委員會辦事處：
中國科學院微生物研究所內，北京。
1．普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)：
中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。
中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS—IV)： 病毒。
2．農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)：
中國農業科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)。
3．工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)：
中國食品發酵工業科學研究所，北京(IFFI)。
4． 醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)：
中國醫學科學院皮膚病研究所，南京(ID)： 真菌。
衛生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌。
中國醫學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
5．抗生素菌種保藏管理中心(CACC)：
中國醫學科學院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工業研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)：生產用抗菌素菌種。
6． 獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC)：
農業部獸醫藥品監察所，北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1．美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州，羅克維爾市。
2．冷泉港研究室(CSH)，美國。
3．國立衛生研究院(NIH)，美國，馬里蘭州，貝塞斯達。
4．美國農業部北方開發利用研究部(NRRL)，美國，皮奧里亞市。
5．威斯康新大學，細菌學系（WB）,美國，威斯康新州馬迪孫。
6．國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國，倫敦。
7．英聯邦真菌研究所(CMI)，英國，丘(園)。
8．荷蘭真菌中心收藏所(CBS)，荷蘭，巴爾恩市。
9．日本東京大學應用微生物研究所(IAM)，日本，東京。
10. 發酵研究所(IFO)，日本，大阪。．
11．日本北海道大學農業部(AHU)， 日本，北海道扎幌市。
12. 科研化學有限公司(KCC)，日本，東京。
13．國立血清研究所(SSI)，丹麥。
14．世界衛生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復壯
5.2.1. 菌種的退化現象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發生變異。變異有正變（自發突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由于培養條件的改變導致菌種形態和生理上的變異與菌種退化區別開來。因為優良菌株的生產性能是和發酵工藝條件緊密相關的。如果培養條件發生變化，如培養基中缺乏某些元素，會導致產孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發酵產量發生波動等。所有這些，只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現象中，最易覺察到的是菌落形態、細胞形態和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產物的生產能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發酵單位的減少，枯草桿菌產淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發酵生產均不利。因此，為了使菌種的優良性狀持久延續下去，必須做好菌種的復壯工作。即在各菌種的優良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。當控制產量的基因發生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發生負突變，則使菌種產孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發生負突變，這時如不及時發現并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后占優勢，從而使整個群體表現出嚴重的退化現象。因此，突變在數量上的表現依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優勢，于是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發生生產性能的突變不是很容易的，但就一個經常處于旺盛生長狀態的細胞而言，發生突變的機率比處于休眠狀態的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環境，使細胞處于休眠狀態，從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理后進行充分的后培養及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養基 有人發現用老苜蓿根汁培養基培養“5406”抗生菌—細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產生菌—藤倉赤霉的培養基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養相對貧乏的培養基做菌種保藏培養基，如培養基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產生的，當培養基營養豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創造良好的培養條件 在生產實踐中，創造和發現一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產孢子能力的退化。
控制傳代次數 由于微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生而表現出來的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發突發的機率。菌種傳代次數越多，產生突變的幾率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現象發生。有人在實踐中發現構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業生產的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以達到恢復菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產性能尚未退化前就經常而有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以達到菌種的生產性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發突變不斷從生產中進行選種的工作。具體的菌種的復壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。
通過寄主進行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內以提高菌株的活力。
聯合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯合處理進行復壯。
在發酵工業中，具有良好性狀的生產菌種的獲得十分不容易，如何利用優良的微生物菌種保藏技術，使菌種經長期保藏后不但存活健在，而且保證高產突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力，即很少發生突變，這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術很多，但原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環境中。具體常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜面傳代保藏；干燥-載體保藏或冷凍干燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面傳代保藏
斜面傳代保藏方法是將菌種定期在新鮮瓊脂斜面培養基上、液體培養基中或穿刺培養，然后在低溫條件下保存。它可用于實驗室中各類微生物的保藏，此法簡單易行，且不要求任何特殊的設備。但此方法易發生培養基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現象。因此要求最好在基本培養基上傳代，目的是能淘汰突變株，同時轉接菌量應保持較低水平。斜面培養物應在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業生產菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養物或穿刺培養物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏，操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養基上生長，然后注入經160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養物1cm為宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗，因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源，還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏，為了預防不測，一般保藏菌株 2~3年也應做一次存活試驗。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當的載體上，如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，制備方法為：將河砂經24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機物，用水漂洗至中性，烘干，然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經真空干燥8 h，于常溫或低溫下保藏均可，保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經風干、粉碎，然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了保藏的結果更加令人滿意，通常在培養物中加入一定的冷凍保護劑；同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養物運輸較困難。
普通冷凍保藏技術(-20℃)：將菌種培養在小的試管或培養瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養物或從瓊脂斜面培養物收獲的細胞分別接到試管或指管內，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應注意的是經過一次解凍的菌株培養物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術：近年來，大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，并發現在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發生率極低。液氮保藏巳成為工業微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養基上培養好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30℃)。待細胞凍結后，將致冷速度降為1℃／min，直到溫度達到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養到最大穩定期后，一般培養放線菌和絲狀真菌約需7~10天，培養細菌約需24~28小時，培養酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為109~1019個/ml，取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養物干燥。最后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規方法保藏的動植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發展，越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它們的載體質粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩定、且其外源質粒復制子很容易丟失。另外，對于宿主細胞質粒基因通常為生長非必需，一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。而由質粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質粒的細胞群體時極為有用。當培養基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協調。由此看來基因工程菌最好應保藏在含低濃度選擇劑的培養基中。例如，質粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養基中加入Amp和Tet，則培養時可選擇出含pBR322質粒的細胞。
5.1.9. 菌種保藏機構
1979年7月，我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM),委托中國科學院負責全國菌種保藏管理業務,并確定了與普通、農業、工業、醫學、抗生素和獸醫等微生物學有關的六個菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應用微生物各學科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經濟建設、科學研究和教育事業服務。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統:
中國微生物菌種保藏管理委員會辦事處：
中國科學院微生物研究所內，北京。
1．普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)：
中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。
中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS—IV)： 病毒。
2．農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)：
中國農業科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)。
3．工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)：
中國食品發酵工業科學研究所，北京(IFFI)。
4． 醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)：
中國醫學科學院皮膚病研究所，南京(ID)： 真菌。
衛生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌。
中國醫學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
5．抗生素菌種保藏管理中心(CACC)：
中國醫學科學院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工業研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)：生產用抗菌素菌種。
6． 獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC)：
農業部獸醫藥品監察所，北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1．美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州，羅克維爾市。
2．冷泉港研究室(CSH)，美國。
3．國立衛生研究院(NIH)，美國，馬里蘭州，貝塞斯達。
4．美國農業部北方開發利用研究部(NRRL)，美國，皮奧里亞市。
5．威斯康新大學，細菌學系（WB）,美國，威斯康新州馬迪孫。
6．國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國，倫敦。
7．英聯邦真菌研究所(CMI)，英國，丘(園)。
8．荷蘭真菌中心收藏所(CBS)，荷蘭，巴爾恩市。
9．日本東京大學應用微生物研究所(IAM)，日本，東京。
10. 發酵研究所(IFO)，日本，大阪。．
11．日本北海道大學農業部(AHU)， 日本，北海道扎幌市。
12. 科研化學有限公司(KCC)，日本，東京。
13．國立血清研究所(SSI)，丹麥。
14．世界衛生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復壯
5.2.1. 菌種的退化現象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發生變異。變異有正變（自發突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由于培養條件的改變導致菌種形態和生理上的變異與菌種退化區別開來。因為優良菌株的生產性能是和發酵工藝條件緊密相關的。如果培養條件發生變化，如培養基中缺乏某些元素，會導致產孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發酵產量發生波動等。所有這些，只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現象中，最易覺察到的是菌落形態、細胞形態和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產物的生產能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發酵單位的減少，枯草桿菌產淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發酵生產均不利。因此，為了使菌種的優良性狀持久延續下去，必須做好菌種的復壯工作。即在各菌種的優良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。當控制產量的基因發生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發生負突變，則使菌種產孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發生負突變，這時如不及時發現并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后占優勢，從而使整個群體表現出嚴重的退化現象。因此，突變在數量上的表現依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優勢，于是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發生生產性能的突變不是很容易的，但就一個經常處于旺盛生長狀態的細胞而言，發生突變的機率比處于休眠狀態的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環境，使細胞處于休眠狀態，從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理后進行充分的后培養及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養基 有人發現用老苜蓿根汁培養基培養“5406”抗生菌—細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產生菌—藤倉赤霉的培養基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養相對貧乏的培養基做菌種保藏培養基，如培養基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產生的，當培養基營養豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創造良好的培養條件 在生產實踐中，創造和發現一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產孢子能力的退化。
控制傳代次數 由于微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生而表現出來的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發突發的機率。菌種傳代次數越多，產生突變的幾率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現象發生。有人在實踐中發現構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業生產的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以達到恢復菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產性能尚未退化前就經常而有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以達到菌種的生產性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發突變不斷從生產中進行選種的工作。具體的菌種的復壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。
通過寄主進行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內以提高菌株的活力。
聯合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯合處理進行復壯。