微生物同其他生物一樣都是具有生命的,微生物細胞直接同生活環(huán)境接觸并不停地從外界環(huán)境吸收適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì),在細胞內(nèi)合成新的細胞物質(zhì)和貯藏物質(zhì),并儲存能量,微生物從環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質(zhì)并加以利用的過程即稱為微生物的營養(yǎng)(nutrition)。
1.1微生物細胞的化學(xué)組成和營養(yǎng)要素
營養(yǎng)物質(zhì)是微生物構(gòu)成菌體細胞的基本原料,也是獲得能量以及維持其它代謝機能必須的物質(zhì)基礎(chǔ)。微生物吸收何種營養(yǎng)物質(zhì)取決于微生物細胞的化學(xué)組成。
1.1.1微生物細胞的化學(xué)組成
分析微生物細胞的化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)微生物細胞與其他生物細胞的化學(xué)組成并沒有本質(zhì)上的差異。微生物細胞平均含水分80%左右。其余20%左右為干物質(zhì),在干物質(zhì)中有蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂類和礦物質(zhì)等。這些干物質(zhì)是由碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鈣、鎂、鐵等主要化學(xué)元素組成,其中碳、氫、氧、氮是組成有機物質(zhì)的四大元素,大約占干物質(zhì)的90%~97%(表3-1)。其余的3%~10%是礦物質(zhì)元素,除上述磷、硫、鉀、鈣、鎂、鐵外,還有一些含量極微的鉬、鋅、錳、硼、鈷、碘、鎳、釩等微量元素。這些礦質(zhì)元素對微生物的生長也起著重要的作用。
表3-1 微生物細胞中碳、氫、氧、氮的含量
微生物種類 C N H O
細菌/ Bacteria 50 15 8 20
酵母/ Yeast 49.8 12.4 6.7 31.1
霉菌/ Mold 47.9 5.2 6.7 40.2
1.1.2 微生物的營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能
通過了解微生物的化學(xué)組成,可見微生物在新陳代謝活動中,必須吸收充足的水分以及構(gòu)成細胞物質(zhì)的碳源和氮以及鈣、鎂、鉀、鐵等多種多樣的礦質(zhì)無素和一些必須的生長輔助因子,才能正常地生長發(fā)育。
⑴ 水分
水分是微生物細胞的主要組成成分,大約占鮮重的70%~90%。不同種類微生物細胞含水量不同。同種微生物處于發(fā)育的不同時期或不同的環(huán)境其水分含量也有差異,幼齡菌含水量較多,衰老和休眠體含水量較少(表3-2)。微生物所含水分以游離水和結(jié)合水兩種狀態(tài)存在,兩者的生理作用不同。結(jié)合水不具有一般水的特性,不能流動,不易蒸發(fā),不凍結(jié),不能作為溶劑,也不能滲透。游離水則與之相反,具有一般水的特性,能流動,容易從細胞中排出,并能作為溶劑,幫助水溶性物質(zhì)進出細胞。微生物細胞游離態(tài)的水同結(jié)合態(tài)的水的平均比大約是4∶1。
表3-2 各類微生物細胞中的含水量
微生物類型 細 菌 霉 菌 酵母菌 芽 孢 孢 子
水分含量(%) 75~85 85~90 75~80 40 38
微生物細胞中的結(jié)合態(tài)水約束于原生質(zhì)的膠體系統(tǒng)之中,成為細胞物質(zhì)的組成成份,是微生物細胞生活的必要條件。游離態(tài)的水是細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物的溶劑及生化反應(yīng)的介質(zhì);一定量的水分又是維持細胞滲透壓的必要條件。由于水的比熱高又是熱的良導(dǎo)體,故能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱量,使細胞溫度不致于驟然升高, 能有效地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的溫度。微生物如果缺乏水分,則會影響代謝作用的進行。
⑵ 碳源物質(zhì)
凡是可以被微生物利用,構(gòu)成細胞代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì),統(tǒng)稱為碳源物質(zhì)。碳源物質(zhì)通過細胞內(nèi)的一系列化學(xué)變化,被微生物用于合成各代謝產(chǎn)物。微生物對碳素化合物的需求是極為廣泛的,根據(jù)碳素的來源不同,可將碳源物質(zhì)分為無機碳源物質(zhì)和有機碳源物質(zhì)。除少數(shù)具有光合色素的藍細菌、綠硫細菌、紫硫細菌、紅螺菌能象綠色植物那樣,利用太陽光能,還原二氧化碳合成碳水化合物,作為碳源以外,一些化能自養(yǎng)型微生物如硝化細菌和硫化細菌還能利用無機物的氧化作為供氫體來還原二氧化碳,同時無機物的氧化還產(chǎn)生化學(xué)能。但絕大多數(shù)的細菌以及全部放線菌和真菌都是以有機物作為碳源的。當(dāng)然不同的微生物對不同碳源的分解和利用情況是不一樣的。糖類是較好的碳源,尤其是單糖(葡萄糖、果糖)、雙糖(蔗糖、麥芽糖、乳糖),絕大多數(shù)微生物都能利用。此外,簡單的有機酸、氨基酸、醇、醛、酚等含碳化合物也能被許多微生物利用。所以我們在制作培養(yǎng)基時常加入葡萄糖、蔗糖作為碳源。淀粉、果膠、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、脂肪、蠟質(zhì)以及碳氫化合物,只要微生物具有分解它們的能力也能加以吸收利用。大多有機碳源物質(zhì)被微生物吸收后,首先要降解成小分子前體物質(zhì),再用于代謝產(chǎn)物的合成,在降解的同時,產(chǎn)生能量;有的被徹底氧化產(chǎn)生能量。所以有機碳源物質(zhì)既提供碳素營養(yǎng),同時又是能源物質(zhì)。
在微生物發(fā)酵工業(yè)中,常根據(jù)不同微生物的需要,利用各種農(nóng)副產(chǎn)品如玉米粉、米糠、麥麩、馬鈴薯、甘薯以及各種野生植物的淀粉,作為微生物生產(chǎn)廉價的碳源。這類碳源往往包含了幾種營養(yǎng)要素。
⑶ 氮源物質(zhì)
微生物細胞中大約含氮5%~13%,它是微生物細胞蛋白蛋和核酸的主要成分。氮素對微生物的生長發(fā)育有著重要的意義,微生物利用它在細胞內(nèi)合成氨基酸和堿基,進而合成蛋白質(zhì)、核酸等細胞成分,以及含氮的代謝產(chǎn)物。無機的氮源物質(zhì)一般不提供能量,只有極少數(shù)的化能自養(yǎng)型細菌如硝化細菌可利用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮作為氮源和能源。
微生物營養(yǎng)上要求的氮素物質(zhì)可以分為三個類型:
①空氣中分子態(tài)氮 只有少數(shù)具有固氮能力的微生物(如自生固氮菌、根瘤菌)能利用。
②無機氮化合物 如銨態(tài)氮(NH4+)、硝態(tài)氮(NO3-)和簡單的有機氮化物(如尿素),絕大多數(shù)微生物可以利用。
③有機氮化合物 大多數(shù)寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有機氮化合物(蛋白質(zhì)、氨基酸)為必需的氮素營養(yǎng)。尿素要經(jīng)微生物先分解成NH4+以后再加以利用。氨基酸能為微生物直接加以吸收利用。蛋白質(zhì)等復(fù)雜的有機氮化合物則需先經(jīng)微生物分泌的胞外蛋白酶水解成氨基酸等簡單小分子化合物后才能吸收利用。
在實驗室和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中,我們常常以銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、魚粉、血粉、蠶蛹粉、豆餅粉、花生餅粉作為微生物的氮源。
⑷ 無機元素
微生物細胞中的礦物元素約占干重的3%~10%左右,它是微生物細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)不可缺少的組成成分和微生物生長不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。許多無機礦物質(zhì)元素構(gòu)成酶的活性基團或酶的激活劑;并具有調(diào)節(jié)細胞的滲透壓,調(diào)節(jié)酸堿度和氧化還原電位以及能量的轉(zhuǎn)移等作用。有些自養(yǎng)微生物需要利用無機礦質(zhì)元素作為能源。根據(jù)微生物對礦質(zhì)元素需要量的不同,分為常量元素和微量元素。
常量礦質(zhì)元素是磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等。磷、硫的需要量很大,磷是微生物細胞中許多含磷細胞成分,如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷(ATP)、輔酶的重要元素。硫是細胞中含硫氨基酸及生物素、硫胺素等輔酶的重要組成成分。鉀、鈉、鎂是細胞中某些酶的活性基團,并具有調(diào)節(jié)和控制細胞質(zhì)的膠體狀態(tài)、細胞質(zhì)膜的通透性和細胞代謝活動的功能。
微量元素有鉬、鋅、錳、鈷、銅、硼、碘、鎳、溴、釩等,一般在培養(yǎng)基中含有0.1mg/L或更少就可以滿足需要。所以在制作培養(yǎng)基時,使用天然水如井水、河水或自來水其中微量元素的含量已經(jīng)足夠,無需添加,過量的微量元素反而對微生物起到毒害作用。
⑸ 生長因子
生長因子是微生物維持正常生命活動所不可缺少的、微量的特殊有機營養(yǎng)物,這些物質(zhì)在微生物自身不能合成,必須在培養(yǎng)基中加入。缺少這些生長因子就會影響各種酶的活性,新陳代謝就不能正常進行。
生長因子是指維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等特殊有機營養(yǎng)物。而狹義的生長因子僅指維生素。這些微量營養(yǎng)物質(zhì)被微生物吸收后,一般不被分解,而是直接參與或調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)。
在自然界中自養(yǎng)型細菌和大多數(shù)腐生細菌、霉菌都能自己合成許多生長輔助物質(zhì),不需要另外供給就能正常生長發(fā)育。
1.2 微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收
微生物不象動物那樣具有專門的攝食器官,也不象植物那樣具有根系吸收營養(yǎng)和水分,它們對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收是借助生物膜的半滲透性及其結(jié)構(gòu)特點以幾種不同的方式來吸收營養(yǎng)物質(zhì)和水分的。如果營養(yǎng)物質(zhì)是大分子的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪,微生物則分泌出相應(yīng)的酶(這類在細胞內(nèi)產(chǎn)生,分泌到細胞外起作用的酶蛋白叫胞外酶)加以分解成小分子的物質(zhì),才能以不同的方式吸收到細胞內(nèi),加以利用。
各種物質(zhì)對細胞質(zhì)膜的透性不一樣,就目前對細胞膜結(jié)構(gòu)及其傳遞系統(tǒng)的研究,認為營養(yǎng)物質(zhì)主要以以下幾種方式透過細胞膜。
1.2.1單純擴散(simple diffusion)
這是通過細胞膜進行內(nèi)外物質(zhì)交換最簡單的一種方式。營養(yǎng)物質(zhì)通過分子的隨機運動透過微生物細胞膜上的小孔進出細胞。其特點是物質(zhì)由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴散(濃度梯度),這是一種單純的物理擴散作用,不需要能量。一旦細胞膜兩側(cè)的濃度梯度消失(即細胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度達到平衡),簡單擴散也就達到動態(tài)平衡。但實際上,進入細胞內(nèi)的物質(zhì)總在不斷被利用,濃度不斷降低,細胞外的物質(zhì)不斷進入細胞。單純擴散是非特異性的,沒有運載蛋白質(zhì)(滲透酶)參與,也不與膜上的分子發(fā)生反應(yīng)。擴散的物質(zhì)本身也不發(fā)生改變。單純擴散的物質(zhì)主要是一些小分子物質(zhì),如一些氣體(O2、CO2)、水、某些無機離子及一些水溶性小分子(甘油、乙醇等)。
1.2.2促進擴散(facilitated diffusion)
單靠單純擴散,對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收是有限的,微生物細胞為了加速對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,以適應(yīng)生長發(fā)育的需要,在細胞膜上還存在多種具有運載營養(yǎng)物質(zhì)功能的特異性蛋白質(zhì),稱為滲透酶。它們大多是誘導(dǎo)酶,當(dāng)外界存在所需的營養(yǎng)物質(zhì)時,能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生相應(yīng)的滲透酶,每一種滲透酶能幫助一類營養(yǎng)物質(zhì)的運輸,如輸送葡萄糖的滲透酶能與外界的葡萄糖分子特異性的結(jié)合,然后轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)膜的內(nèi)表面后,再釋放到細胞質(zhì)中,并加速過程的進行。又如腸道桿菌吸收甘油的過程也是由滲透酶促進的擴散。它們?nèi)缤岸纱币粯樱褷I養(yǎng)物質(zhì)由外界運輸?shù)郊毎ぶ腥ァF涮攸c也是由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴散,所不同的地方是這種運輸有滲透酶參與,加速了營養(yǎng)物質(zhì)的透過程度,以滿足微生物細胞代謝之需要。細胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度可以通過自由可逆的擴散而趨向平衡。促進擴散過程是由濃度梯度來驅(qū)動的,不需耗費代謝能量。
現(xiàn)在已分離出有關(guān)葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、磷酸、Ca2+、Na+、K+等的載體蛋白,它們的分子量介于9000~40000Da之間,而且都是單體。促進擴散是真核生物的普遍運輸機制,如酵母菌運輸糖類就是通過這種方式,但在原核生物中卻少見,在厭氧微生物中,促進擴散的過程常參與某些化合物的吸收和發(fā)酵產(chǎn)物的排出。然而在好氧微生物中這種傳遞機制似乎不太重要。
1.2.3 主動運輸(active transport)
如果微生物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收只能憑借濃度梯度由高濃度向低濃度擴散,那么微生物就無法吸收低于細胞內(nèi)濃度的外界營養(yǎng)物質(zhì),生長就會受到限制。事實上微生物細胞中有些營養(yǎng)物質(zhì)以高于細胞外的濃度在細胞內(nèi)積累,如大腸桿菌在生長期中,細胞中的鉀離子濃度比周圍環(huán)境高出3000倍。當(dāng)以乳糖作為碳源時,細胞內(nèi)乳糖的濃度比周圍環(huán)境高出500倍。可見這種主動運輸?shù)奶攸c是營養(yǎng)物質(zhì)由低濃度向高濃度進行,是逆濃度梯度地被“抽”進細胞內(nèi)的,因此這個過程不僅需要滲透酶,還需要代謝能量,能量由腺三磷(ATP)提供,滲透酶起著將營養(yǎng)物質(zhì)從低濃度的周圍環(huán)境轉(zhuǎn)運進高濃度的細胞內(nèi)不斷改變平衡點的作用。
存在于細胞膜上的滲透酶,當(dāng)細胞膜外存在著重要結(jié)合的營養(yǎng)物質(zhì)時,能分辨(認識)這些物質(zhì),由于對其營養(yǎng)物質(zhì)具有高度親和力,并且特異性地與之結(jié)合,形成滲透酶-運載物質(zhì)復(fù)合體。復(fù)合體旋轉(zhuǎn)180°從膜外方轉(zhuǎn)移到細胞膜內(nèi)表面,消耗代謝能量ATP,使?jié)B透酶構(gòu)型發(fā)生變化,親和力減弱,于是被結(jié)合的物質(zhì)則被釋放到細胞質(zhì)中去。構(gòu)型變化的滲透酶,再獲得能量恢復(fù)原狀,親和力增強,結(jié)合位置朝向膜外,又可重復(fù)進行這種主動運輸。大腸桿菌對乳糖的吸收是研究得比較深入的,其滲透酶為β-半乳糖苷酶,它是由 lacr 基因控制的,這種酶可在膜內(nèi)外特異性地同乳糖結(jié)合,但在膜內(nèi)結(jié)合比膜外差得多,這就在于代謝能量ATP→ADP釋放的能量,使酶蛋白構(gòu)型發(fā)生變化而達到膜內(nèi),并在膜內(nèi)降低其對乳糖的親和力而在膜內(nèi)釋放出來,從而實現(xiàn)乳糖由細胞外的低濃度向細胞膜內(nèi)的高濃度轉(zhuǎn)運的。
1.2.4 基團轉(zhuǎn)位(group translocation)
在微生物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的過程中,還有一種特殊的運輸方式,叫基團轉(zhuǎn)位。這種方式除具有主動運輸?shù)奶攸c外,主要是被轉(zhuǎn)運的物質(zhì)改變了本身的性質(zhì),有化學(xué)基團轉(zhuǎn)移到被轉(zhuǎn)運的營養(yǎng)物質(zhì)上面去。如許多糖及其糖的衍生物在運輸中由細菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系催化,使其磷酸化,磷酸基團被轉(zhuǎn)移到它們分子上,以磷酸糖的形式進入細胞。由于質(zhì)膜對大多數(shù)磷酸化化合物無透性,磷酸糖一旦形成便被阻擋在細胞以內(nèi)了,從而使糖濃度遠遠超過細胞外。
這種運輸過程的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)包括酶Ⅰ、酶Ⅱ和熱穩(wěn)定蛋白(HPr)。酶Ⅰ是非特異性的,它們對許多糖都一樣起作用。酶Ⅱ是膜上的結(jié)構(gòu)酶,并能誘導(dǎo)產(chǎn)生,它對某一種糖具有特異性,只能運載某一種糖類,酶Ⅱ同時起著滲透酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用。HPr是熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì),它能夠象高能磷酸載體一樣起作用。該酶系統(tǒng)催化的反應(yīng)分兩步進行:
1) 少量的 HPr 被磷酸烯醇丙酮酸 (PEP) 磷酸化:
酶Ⅰ
PEP + Hpr 磷酸~HPr+丙酮酸
2)磷酸~HPr 將它的磷酰基傳遞給葡萄糖,同時將生成的6-磷酸葡萄糖釋放到細胞質(zhì)內(nèi)。這步復(fù)合反應(yīng)由酶Ⅱ催化。
酶Ⅱ
磷酸~Hpr + 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 + HPr
基團轉(zhuǎn)位可轉(zhuǎn)運糖、糖的衍生物,如葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺和β-半乳糖苷以及嘌呤、嘧啶、堿基、乙酸(但不能輸送氨基酸)等。這個運輸系統(tǒng)主要存在于兼性厭氧菌的和厭氧菌中。但某些好氧菌,如枯草桿菌和巨大芽孢桿菌(B. megatherium)也利用磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將葡萄糖傳送到細胞內(nèi)。
目前關(guān)于細菌對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的四種主要運輸系統(tǒng)的主要機理可以概括成下面的圖解(圖3-1);總之,微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收不是簡單的物理、化學(xué)的過程,而是復(fù)雜的生理過程。是微生物對營養(yǎng)物質(zhì)起能動的、選擇吸收的作用。它是受細胞膜的特性和功能以及微生物本身代謝強度所支配的。
1.3 微生物的營養(yǎng)類型
微生物在長期進化過程中,由于生態(tài)環(huán)境的影響,逐漸分化成各種營養(yǎng)類型。由于各種微生物的生活環(huán)境和對不同營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力不同,它們的營養(yǎng)需要和代謝方式也不盡相同。根據(jù)微生物對碳源的要求是無機碳化合物(如二氧化碳、碳酸鹽)還是有機碳化合物可以把微生物分成自養(yǎng)型微生物和異養(yǎng)型微生物兩大類。此外,根據(jù)微生物生命活動中能量的來源不同,將微生物分為兩種能量代謝類型,一種是利用吸收的營養(yǎng)物質(zhì)的降解產(chǎn)生的化學(xué)能,稱為化能型微生物;另一類是吸收光能來維持其生命活動,稱為光能型微生物。將碳源物質(zhì)的性質(zhì)和代謝能量的來源結(jié)合將微生物分為光能自養(yǎng)型、光能異養(yǎng)型、化能自養(yǎng)型和化能異養(yǎng)型四種營養(yǎng)類型,它們的區(qū)別見表3-3。
表3-3 微生物的營養(yǎng)類型
代謝特點 營養(yǎng)類型
光能自養(yǎng)型 化能自養(yǎng)型 光能異養(yǎng)型 化能異養(yǎng)型
碳 源 CO2或可溶性碳酸鹽 CO2或可溶性碳酸鹽 小分子有機物 有 機 物
能 源 光 能 無機物的氧化 光 能 有機物的氧化降解
供 氫 體 無機物(H2O、H2S等) 無機物(H2S、H2、Fe2+ 、NH3、NO2-等) 小分子有機物 有機物
代 表 種 藍細菌、綠硫細菌 硝化細菌、硫化菌、氫細菌、鐵細菌等 紅 螺 菌 大多數(shù)細菌,全部真菌、放線菌
1.3.1光能自養(yǎng)型微生物
利用光能為能源,以二氧化碳(CO2)或可溶性的碳酸鹽(CO32-)作為唯一的碳源或主要碳源。以無機化合物(水、硫化氫、硫代硫酸鈉等)為氫供體,還原CO2,生成有機物質(zhì)。光能自養(yǎng)型微生物主要是一些藍細菌、紅硫細菌、綠硫細菌等少數(shù)微生物,它們由于含光合色素,能使光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能(ATP),供細胞直接利用。
光
藍細菌 CO2+2H2O [CH2O]+H2O+O2↑
葉綠素
光
綠硫細菌 CO2+2H2S [CH2O]+H2O+2S
菌綠素
比較以上兩反應(yīng),可寫成以下通式:
光
CO2+2H2A [CH2O]+H2O+2A
光合色素
1.3.2 化能自養(yǎng)微生物
這一類微生物的能源來自無機物氧化所產(chǎn)生的化學(xué)能,利用這種能量去還原CO2或者可溶性碳酸鹽合成有機物質(zhì)。
如亞硝酸細菌、硝酸細菌、鐵細菌、硫細菌、氫細菌就可以分別利用氧化NH3、NO2-、Fe++、H2S和H2產(chǎn)生的化學(xué)能來還原CO2,形成碳水化合物。
例如:亞硝酸細菌能從氧化氨為亞硝酸中獲得能量,用以還原二氧化碳,形成碳水化合物。
亞硝酸細菌
2NH3+3O2+2H2O 2HNO2+4H++4OH-+能量
CO2+4H+ [CH2O]+H2O
這一類型的微生物完全可以生活在無機的環(huán)境中,分別氧化各自合適的還原態(tài)的無機物,從而獲得同化CO2所需的能量。
1.3.3 光能異養(yǎng)型微生物
這種類型的微生物以光能為能源,利用有機物作為供氫體,還原CO2,合成細胞的有機物質(zhì)。
例如深紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)利用異丙醇作為供氫體,進行光合作用并積累丙酮,這類微生物生長時大多需要外源性的生長因素。
CH3 光
2 CHOH + CO2 2CH3COCH3+[CH2O]+H2O
CH3 光合色素
此菌在光和厭氧條件下進行上述反應(yīng)。但在黑暗和好氧條件下又可能用有機物氧化產(chǎn)生的化學(xué)能推動代謝作用。
1.3.4 化能異養(yǎng)型微生物
這種類型的微生物其能源和碳源都來自于有機物,能源來自有機物的氧化分解,ATP通過氧化磷酸化產(chǎn)生,碳源直接取自于有機碳化合物。它包括自然界絕大多數(shù)的細菌,全部的放線菌、真菌和原生動物。
根據(jù)生態(tài)習(xí)性微生物可分為腐生型和寄生型兩類:①腐生型:從無生命的有機物獲得營養(yǎng)物質(zhì)。引起食品腐敗變質(zhì)的某些霉菌和細菌就屬這一類型。如引起腐敗的梭狀芽孢桿菌、毛霉、根霉、曲霉等;②寄生型:必須寄生在活的有機體內(nèi),從寄主體內(nèi)獲得營養(yǎng)物質(zhì)才能生活稱為寄生,這類微生物叫寄生微生物。寄生又分為絕對寄生和兼性寄生,如果只能在一定活的生物體內(nèi)營寄生生活的叫絕對寄生,它們是引起人、動物、植物以及微生物病害的病原微生物,如病毒、噬菌體、立克次氏體。
有些微生物能生活在活的生物體上,又能在死的有機殘體上生長同時也可在人工培養(yǎng)基上生長的大多數(shù)病原微生物屬于兼性寄生微生物,如人和動物腸道內(nèi)普遍存在的大腸桿菌,它生活在人和動物腸道內(nèi)是寄生,隨糞便排除體外,又可在水、土壤和糞便之中腐生。又如引起瓜果腐爛的瓜果腐霉的菌絲可侵入果樹幼苗的胚芽基部進行寄生,也可以在土壤中長期進行腐生。
上述營養(yǎng)類型的劃分并非是絕對的,只是根據(jù)主要方面決定的。絕大多數(shù)異養(yǎng)型微生物也能吸收利用CO2,可以把CO2加至丙酮酸上生成草酰乙酸,這是異養(yǎng)生物普遍存在的反應(yīng)。因此,劃分異養(yǎng)型微生物和自養(yǎng)型微生物時的標(biāo)準(zhǔn)不在于它們能否利用CO2,而在于它們是否能利用CO2作為唯一的碳源或主要碳源。在自養(yǎng)型和異養(yǎng)型之間、光能型和化能型之間還存在一些過渡類型。例如氫細菌(Hydrogenmonas)就是一種兼性自養(yǎng)型微生物類型,在完全無機的環(huán)境中進行自養(yǎng)生活,利用氫氣的氧化獲得能量,將CO2還原成細胞物質(zhì)。但如環(huán)境中存在有機物質(zhì)時又能直接利用有機物進行異養(yǎng)生活。
1.4 培養(yǎng)基(medium)
為了研究和利用微生物,必須人為地創(chuàng)造適宜的環(huán)境培養(yǎng)微生物,培養(yǎng)基是指經(jīng)人工配制而成的適合微生物生長繁殖和積累代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)基質(zhì)。我們配制培養(yǎng)基不但需要根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)要求,加入適當(dāng)種類和數(shù)量的營養(yǎng)物;并要注意一定的碳氮比例(C/N);還要調(diào)節(jié)適宜的酸堿度(pH);保持適當(dāng)?shù)难趸原電位和滲透壓。
1.4.1配制培養(yǎng)基的基本原則
配制微生物的培養(yǎng)基,主要考慮以下幾個因素:
⑴ 符合微生物菌種的營養(yǎng)特點:
不同的微生物對營養(yǎng)有著不同的要求,所以,在配制培養(yǎng)基時,培養(yǎng)基的營養(yǎng)搭配及搭配比例首先要考慮到這一點,明確培養(yǎng)基的用途,如用于培養(yǎng)何種微生物,培養(yǎng)的目的如何,是培養(yǎng)菌種還是用于發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵生產(chǎn)的目的是獲得大量菌體還是獲得次級代謝產(chǎn)物等,根據(jù)不同的菌種及其不同的培養(yǎng)目的確定搭配的營養(yǎng)成分及營養(yǎng)比例。
營養(yǎng)的要求主要是對碳素和氮素的性質(zhì),如果是自養(yǎng)型的微生物則主要考慮無機碳源,如果是異樣型的微生物,主要提供有機碳源物質(zhì);除碳源物質(zhì)外,還要考慮加入適量的無機礦物質(zhì)元素;有些微生物菌種在培養(yǎng)時還要求加入一定的生長因子,如很多乳酸菌在培養(yǎng)時,要求在培養(yǎng)基中加入一些氨基酸和維生素等才能很好地生長。
除營養(yǎng)物質(zhì)要求外,還要考慮營養(yǎng)成分的比例適當(dāng),其中碳素營養(yǎng)與氮素營養(yǎng)的比例很重要。C/N 比是指培養(yǎng)基中所含 C 原子的摩爾濃度與 N 原子的摩爾濃度之比,不同的微生物菌種要求不同的 C/N 比,同一菌種,在不同的生長時期也有不同的要求,一般 C/N 比在配制發(fā)酵生產(chǎn)用培養(yǎng)基時,要求比較嚴格, C/N 比例對發(fā)酵產(chǎn)物的積累影響很大;一般在發(fā)酵工業(yè)上,發(fā)酵用種子的培養(yǎng),培養(yǎng)基的營養(yǎng)越豐富越好,尤其是 N 源要豐富,而對以積累次級代謝產(chǎn)物為發(fā)酵目的的發(fā)酵培養(yǎng)基,則要求提高 C/N 比值,提高 C 素營養(yǎng)物質(zhì)的含量。
⑵ 適宜的理化條件
除營養(yǎng)成分外,培養(yǎng)基的理化條件也直接影響微生物的生長和正常代謝,其中主要有:
1) pH 微生物一般都有它們適宜的生長pH 范圍,細菌的最適pH 一般在pH 7~8范圍,放線菌要求pH 7.5~8.5范圍,酵母菌要求pH 3.8~6.0, 霉菌的適宜pH 為4.0~5.8。
由于微生物在代謝過程中,不斷地向培養(yǎng)基中分泌代謝產(chǎn)物,影響培養(yǎng)基的pH變化,對大多數(shù)微生物來說,主要產(chǎn)生酸性產(chǎn)物,所以在培養(yǎng)過程中常引起pH的下降,影響微生物的生長繁殖速度。為了盡可能地減緩在培養(yǎng)過程中pH的變化,在配制培養(yǎng)基時,要加入一定的緩沖物質(zhì),通過培養(yǎng)基中的這些成分發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,常用的緩沖物質(zhì)主要有以下兩類:
① 磷酸鹽類。這是以緩沖液的形式發(fā)揮作用的,通過磷酸鹽的不同程度的解離,對培養(yǎng)基的pH的變化起到緩沖作用,其緩沖原理是:
H+ + HPO4= H2PO4-
OH+ + H2PO4 - H2O + HPO4 =
② 碳酸鈣。這類緩沖物質(zhì)是以“備用堿”的方式發(fā)揮緩沖作用的,碳酸鈣在中性條件下的溶解度極低,加入到培養(yǎng)基后,由于其在中性條件下幾乎不解離,所以不影響培養(yǎng)基的pH的變化,當(dāng)微生物生長,培養(yǎng)基的pH下降時,碳酸鈣就不斷地解離,游離出碳酸根離子,碳酸根離子不穩(wěn)定,與氫離子形成碳酸,最后釋放出二氧化碳,在一定程度上緩解了培養(yǎng)基pH的降低。
+H+
CO32— H2CO3 CO2+ H2O
- H+
2) 滲透壓 由于微生物細胞膜是半通透膜,外有細胞壁起到機械性保護作用,要求其生長的培養(yǎng)基具有一定的滲透壓,當(dāng)環(huán)境中的滲透壓低于細胞原生質(zhì)的滲透壓時,就會出現(xiàn)細胞的膨脹,輕者影響細胞的正常代謝,重者出現(xiàn)細胞破裂;當(dāng)環(huán)境滲透壓高于原生質(zhì)的滲透壓時,導(dǎo)致細胞皺縮,細胞膜與細胞壁分開,即所謂質(zhì)壁分離現(xiàn)象。只有在等滲條件下最適宜微生物的生長。
1.4.2 培養(yǎng)基的類型
⑴ 根據(jù)營養(yǎng)成分的來源劃分
1) 天然培養(yǎng)基(complex medium; undefined medium) 是利用一些天然的動植物組織器官和抽提物,如牛肉膏、蛋白胨、麩皮、馬鈴薯、玉米漿等制成。它們的優(yōu)點是取材廣泛,營養(yǎng)全面而豐富,制備方便,價格低廉,適宜于大規(guī)模培養(yǎng)微生物之用。缺點是成分復(fù)雜,每批成分不穩(wěn)定。我們實驗室常用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基便是這種類型。
2) 合成培養(yǎng)基(defined medium; synthetic medium) 是利用已知成分和數(shù)量的化學(xué)物質(zhì)配制而成。此類培養(yǎng)基成分精確,重復(fù)性強,一般用于實驗室進行營養(yǎng)代謝、分類鑒定和選育菌種等工作。缺點是配制較復(fù)雜,微生物在此類培養(yǎng)基上生長緩慢,加上價格較貴,不宜用于大規(guī)模生產(chǎn)。如實驗室常用的高氏1號培養(yǎng)基,察氏培養(yǎng)基。
3) 半合成培養(yǎng)基(semi-defined medium) 用一部分天然物質(zhì)作為碳氮源及生長輔助物質(zhì),又適當(dāng)補充少量無機鹽類,這樣配制的培養(yǎng)基叫半合成培養(yǎng)基。如實驗室常用的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。半合成培養(yǎng)基應(yīng)用最廣,能使絕大多數(shù)微生物良好地生長。
⑵ 根據(jù)物理狀態(tài)劃分
1) 液體培養(yǎng)基(liquid medium) 把各種營養(yǎng)物質(zhì)溶解于水中,混合制成水溶液,調(diào)節(jié)適宜的pH,成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基質(zhì)。該培養(yǎng)基有利于微生物的生長和積累代謝產(chǎn)物,常用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和觀察微生物生長特征和研究生理生化特性。
2) 固體培養(yǎng)基(solid medium) 一般采用天然固體營養(yǎng)物質(zhì),如馬鈴薯塊、麩皮等作為培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)基質(zhì)。亦有在液體培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑,如瓊脂(1.5%~2.0%)、明膠等煮沸冷卻后,使凝成固體狀態(tài),常用來觀察、鑒定和分離純化微生物。
3) 半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium) 加入少量凝固劑(0.5%~0.8%的瓊脂)則成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基叫半固體培養(yǎng)基,常用來觀察細菌的運動,鑒定菌種噬菌體的效價滴定和保存菌種。
⑶ 根據(jù)用途劃分
1) 加富培養(yǎng)基(enriched medium) 根據(jù)培養(yǎng)菌種的生理特性加入有利于該種微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì),該種微生物則會旺盛地大量生長,如加入血、血清、動植物組織提取液等以培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)微生物。加富培養(yǎng)基主要用于菌種的保存或用于菌種的分離篩選。
2) 選擇培養(yǎng)基(selectic medium) 根據(jù)某種或某一類微生物特殊的營養(yǎng)要求,配制而成的培養(yǎng)基,如纖維素選擇培養(yǎng)基。還有在培養(yǎng)基中加入對某種微生物有抑制作用,而對所需培養(yǎng)菌種無影響的物質(zhì),從而使該種培養(yǎng)基對某種微生物有嚴格的選擇作用。如SS瓊脂培養(yǎng)基,由于加入膽鹽等抑制劑,對沙門氏菌等腸道致病菌無抑制作用,而對其它腸道細菌有抑制作用。
3) 鑒別培養(yǎng)基(differencial medium) 根據(jù)微生物的代謝特點通過指示劑的顯色反應(yīng)用以鑒定不同微生物的培養(yǎng)基。如遠滕氏培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉使指示劑復(fù)紅醌式結(jié)構(gòu)還原變淺,但由于大腸桿菌生長分解乳糖,產(chǎn)生的乙醛可使復(fù)紅醌式結(jié)構(gòu)恢復(fù),可使菌落中的指示劑復(fù)紅,重新呈現(xiàn)帶金屬光澤的紅色,而同其它微生物區(qū)別開來。
ATP ADP Gln Glu
葡萄糖 6-磷酸-葡萄糖 6-磷酸-果糖 6-磷酸-葡萄糖