病毒(virus)是一類比細菌更微小,能通過細菌濾器,只含一種類型的核酸(DNA或RNA),僅能在活細胞內生長繁殖的非細胞形態的微生物。
從1892年俄國科學家伊萬諾夫斯基發現煙草花葉病毒以后,牛口蹄疫病毒、人黃熱病毒、細菌病毒(即噬菌體)、昆蟲病毒相繼被發現。近年來,繼真菌病毒后又發現了藍綠藻病毒、支原體病毒等。隨著現代科學技術的發展,特別是超速離心機和電子顯微鏡等先進儀器的問世,對病毒的研究已進入了一個新階段。現已發現的各種病毒有3 600多種,它們廣泛分布在自然界中,無論動物、植物和人類都可受到病毒的危害。例如:由微生物引起的人類傳染性疾病,就有80%是由病毒所引起。病毒性疾病的重要特點是:傳染性高,流行面廣,有較高的死亡率。目前還發現許多腫瘤疾病也與病毒有關。因此,掌握病毒的特性,認識病毒的傳染和發病特點,對控制病毒帶給人類的危害,防止病毒對食品造成污染,以及減少發酵食品生產中因噬菌體污染而造成的損失均有一定的意義。
現在,病毒不僅是病毒學研究的對象,而且也成為分子生物學和分子遺傳學的主要研究對象,研究病毒對這兩門學科的發展產生了重大的影響。人們利用噬菌體對細菌作用的專一性,進行細菌分型鑒定或細菌病治療;在分子生物學研究中,它作為載體應用于遺傳工程上;在食品工業發酵生產中,噬菌體是造成生產菌種污染的因素之一。
4.1 病毒的形態結構及主要類群
4.1.1 病毒的基本特點
病毒比其它微生物結構更簡單,它是由蛋白質圍繞著核酸組成的復合分子構成的,為非細胞結構型,而且只有一種核酸,核酸構成病毒的基因組,病毒沒有完整的酶系統。
病毒不能在人工培養基上繁殖,必須進入活細胞中,依靠寄主細胞供給能量、養料、酶類等才能增殖,在寄主細胞內的增殖是以自我復制的方式形成新的病毒粒子。某些病毒的基因片段,也可以整合到寄主細胞核染色體的基因組中,并隨細胞DNA的復制而復制,引起潛伏感染。
在活細胞內生活的病毒,對于能干擾細胞代謝的各種因素具有明顯的抵抗力。如對甘油有耐受作用,不像細菌等微生物那樣可被甘油脫水而死亡,也能抵抗多種抗生素的作用,但干擾素可阻止它的生長和成熟。
4.1.2 病毒的形狀和大小
成熟的具有侵染力的病毒顆粒稱為病毒粒子(virion)。在電子顯微鏡下觀察到的病毒粒子一般為球狀、棒桿狀、蝌蚪狀和線狀等多種形態。人、動物和真菌的病毒大多呈球狀(如腺病毒、蘑菇病毒),少數為彈狀或磚狀(如彈狀病毒、痘病毒)。植物病毒和昆蟲病毒則多數為線狀和桿狀(如煙草花葉病毒、家蠶核型多角體病毒),少數為球狀(如花椰菜花葉病毒)。細菌病毒稱噬菌體(bacteriophage),部分呈蝌蚪狀(T2,T4,λ噬菌體),部分線狀(fd、M13等)或球狀(MS2、φX174等)(圖2-55)。
病毒個體用納米(nm)來量度。病毒的大小懸殊,直徑在10~300nm之間,通常在100nm左右。較大的病毒如痘類病毒,其大小為250~300nm×200~50nm,比最小的細菌支原體(直徑200~250nm)還大。最小的病毒如菜豆畸矮病毒,粒子大小僅為9~11nm,比血清蛋白分子(直徑22nm)還小。
病毒在寄主外存在時,只保留著在適宜條件下感染寄主的潛在能力。這種潛在的感染能力很容易變性失活。它對溫度很敏感,在55~60℃,病毒懸液幾分鐘內就變性。Χ-射線、γ-射線、紫外線照射都能使病毒變性失活,帶封套的病毒容易被脂肪溶劑破壞,無封套的病毒對多種常用的消毒劑的抗性較強。常用甲醛來消毒污染了病毒的器具和空氣。
由于病毒沒有細胞結構,不能在寄主細胞外面獨立復制,因而有的學者只把它們看成是一種遺傳成分,同質粒有所類似。
4.1.3 病毒的結構與化學組成
(1)病毒粒子的結構 病毒主要由殼體(capsid)和核酸二部分構成。殼體和核酸統稱為核殼(nucleo-capsid)。有些病毒在核殼外還有一層外套稱包膜(envelope),有的包膜上還有刺突(spike)。包膜由脂肪或蛋白組成。殼體的化學成分是蛋白質,由稱為殼粒(capsomer)的亞單位組成。殼粒是電鏡下能見的最小形態學單位,由一種或多種肽鏈折疊而成。
由于殼粒在殼體上的不同排列,病毒具有下列3種形態結構。
①螺旋對稱 具有螺旋對稱結構的病毒多數是單鏈RNA病毒,其粒子形態為線狀(如大腸桿菌噬菌體f1)、直桿狀(如煙草花葉病毒)和彎曲桿狀(如馬鈴薯X病毒)。這類病毒的殼體由殼粒一個挨一個地呈螺旋對稱排列而成,核酸位于殼體的螺旋狀結構中。煙草花葉病毒的桿狀殼體由2 130個殼粒螺旋狀排列而成,約有130個螺旋,螺距為2.35nm,殼體全長約300nm 。
②二十面體對稱 有些看起來好象球形的病毒粒子,經高分辨率電子顯微鏡觀察,實際上是個多面體。它們的核殼是由不同數量的殼粒按一定方式排列而成的立方對稱體。這些殼粒沿三根相互垂直的軸形成對稱體,殼體一般廿面體。廿面體具有20個面(每個面是一個等邊三角形),30條棱和12個頂角。腺病毒的殼體是這類結構的典型代表,它由252個球形的殼粒排列成一個廿面的對稱體。
③復合對稱 這類病毒的殼體是由兩種結構組成的,既有螺旋對稱部分,又有立方體對稱部分,故稱復合對稱,如大腸桿菌T4噬菌體。T4噬菌體如蝌蚪狀,其頭部外殼由8種蛋白質組成呈橢圓形20面體,含212個殼粒,核酸埋藏在蛋白質外殼中。T4噬菌體的尾部為螺旋對稱結構,含有兩種分子量較大的蛋白質和4種分子量較小的蛋白質,由144個殼粒組成排成棒狀,共分24個螺旋。尾部中央為尾髓,中空,是注射核酸的通道。除此之外,T4還有頸圈,基片,刺突和尾絲等附屬結構。
(2)病毒的化學組成 多數病毒只含蛋白質和核酸兩種成分。少數大型病毒還含有脂類和糖類。
①病毒蛋白 病毒一般只含一種或少數幾種蛋白。蛋白質在病毒中的含量隨病毒種類而異,如狂犬病毒的蛋白質含量約占整個病毒粒子的96%,而大腸桿菌T3、T4 噬菌體則只占40%。
病毒蛋白的氨基酸組成和其他生物一樣,但半胱氨酸和組氨酸在病毒蛋白中較少見。不同種病毒蛋白的氨基酸含量各不相同,大腸桿菌噬菌體M13的外殼蛋白只有49個氨基酸,煙草花葉病毒普通株的外殼蛋白有158個氨基酸,家蠶核型多角體病毒蛋白有244個氨基酸。病毒蛋白多數位于病毒顆粒的外層,包在核酸外面,以保護核酸免受破壞。有些病毒蛋白與吸附細胞受體有關(如流感病毒的血凝素等),有些則是一些酶,如噬菌體的溶菌酶、白血病病毒的DNA聚合酶、RNA腫瘤病毒的反轉錄酶等。它們在病毒的侵染和增殖過程中發揮作用。
②病毒核酸 病毒只含一類核酸(DNA或RNA),至今還沒發現一種病毒同時兼有兩類核酸。大多數植物病毒的核酸為RNA,少數為DNA;噬菌體的核酸大多數為DNA,少數為RNA;動物病毒,包括昆蟲病毒,則部分是DNA,部分是RNA。含DNA的病毒稱為DNA病毒,含RNA的病毒稱為RNA病毒。
無論是DNA還是RNA,都有單鏈(ss)和雙鏈(ds)之分。RNA病毒多數是單鏈,極少數為雙鏈,DNA病毒多數為雙鏈,少數為單鏈。病毒核酸還有線狀和環狀之分,如玉米條紋病毒的核酸為線狀單鏈DNA,大麗菊花葉病毒的核酸為閉合環狀雙鏈DNA。但RNA病毒核酸都呈線狀,罕見環狀。
此外,病毒核酸還有正、負鏈的區別。凡堿基排列順序與mRNA相同的單鏈DNA或RNA,稱(+)DNA鏈或(+)RNA鏈,凡堿基排列順序與mRNA互補的單鏈DNA和RNA,稱(-)DNA 鏈或(-)RNA鏈。如煙草花葉病毒的核酸屬于(+)RNA,副黏病毒的核酸為(-)RNA。正鏈(+)核酸具有侵染性,可直接作為mRNA合成蛋白質,負鏈(-)沒有侵染性,必須依靠病毒攜帶的轉錄酶轉錄成正鏈后才能作為mRNA合成蛋白質。
大部分病毒的遺傳物質為DNA,少數RNA病毒能以RNA為遺傳物質。病毒的核酸主要也由4種核苷酸組成。但病毒所含的核苷酸數比高等生物少得多,一般只含103~106個核苷酸。
有些RNA病毒的核酸分子還有分段現象。如流感病毒的核酸分為8個節段,每個節段都有自己獨特的核苷酸序列,分別轉錄一種蛋白質。有些分段核酸分散在不同的病毒顆粒中,如煙草脆裂病毒的核酸就分藏在兩種長短不一的顆粒中,長顆粒含2.5×106Da的RNA,有RNA復制基因,具有侵染性;短顆粒含0.6~7.3×106 Da的RNA,有蛋白質外殼基因。煙草脆裂病毒只有在長顆粒和短顆粒一起感染細胞時才能正常復制。
病毒的核酸含量隨病毒種類而異,通常在1%~50%之間。一般形態結構復雜的病毒,核酸含量較多,如結構簡單的新城疫病毒核酸含量不到1%,而結構復雜的T2噬菌體核酸含量超過50%,這是因為結構復雜的病毒需要較多的基因。
③脂類和糖類 少數有包膜的大型病毒含有蛋白質和核酸外,還含有脂類和糖類等其他成分。如大蚊紅色病毒含有5% 脂類,流感病毒除含19% 脂類外,還含有6% 的非核糖成分的糖類。
病毒所含的脂類主要是一些磷脂、膽固醇和中性脂肪,它們大多數存在于包膜中。病毒所含的糖,主要是葡萄糖、龍膽二糖、巖藻糖、半乳糖等。它們或以糖苷鏈直接與堿基相連,或以氨基酸殘基相連,以糖蛋白的形式存在。糖蛋白位于有包膜病毒的表面,已知它與血清反應有關。
④病毒的包含體 有些病毒在寄主細胞內還形成包含體的結構,它們多數位于細胞質內,具嗜酸性;少數位于細胞核內,具嗜堿性;也有細胞質和細胞核內都存在的類型。包含體是寄主細胞被病毒感染后形成的蛋白質結晶體,內含1個到幾個病毒粒子。包含體的個體較大,在光學顯微鏡下就能看到,包含體有多角形和顆粒形兩種,前者稱為多角形包含體,后者稱為顆粒狀包含體。顆粒狀包含體呈圓筒形或橢圓形,內含1個(偶爾2個)病毒粒子。多角形包含體一般呈六角形、五角形、四角形和三角形,內含多個病毒粒子。
4.1.4 病毒的主要類群
自從1892年伊萬諾夫斯基發現病毒以來,迄今已發現了3 600多種病毒。很多病毒學家對病毒的分類作了不懈的努力,探索了很多的途徑,提出 了大量的方案,但目前還不成熟,還不完善。人們仍然根據病毒對宿主感染的專一性,按宿主的不同將病毒分為微生物病毒、植物病毒、脊椎動物病毒和昆蟲病毒。
(1)微生物病毒 侵染細菌、放線菌等原核微生物的病毒,通常稱為噬菌體,微生物病毒廣泛存在于自然界中,在真菌、藍綠藻中也發現有病毒的感染。據報道,至今已作過電鏡觀察的噬菌體至少已有2 850種(株),其中2 700種(株)是有尾的,噬菌體在病毒學中以E.coli中發現的噬菌體最多,是研究最深入的。
(2)植物病毒 植物病毒大部分屬于ssRNA病毒,其基本形態有桿狀、絲狀和等軸對稱的近球狀二十面體,一般沒有包膜。只有少數種類才有包膜,例如植物彈狀病毒組的萵苣壞死黃化病病毒等。植物病毒雖是嚴格的細胞內寄生物,但是它們的專化性并不強,往往一種病毒可寄生在不同種、屬甚至不同科的植物上,例如TMV就可以傳染10多個科,100多種草本和木本植物。
已知的植物病毒多達600多種,絕大多數為種子植物,尤其是禾本科、葫蘆科、豆科、十字花科等植物都易發生病毒病。植物患病毒病后,主要出現三類癥狀:因葉綠體被破壞或不能合成新的葉綠素,而引起花葉、黃化或紅化等癥狀;植株發生矮化、叢枝或畸形等;形成枯斑或壞死等癥狀。
(3)脊椎動物病毒 在人類、哺乳動物、禽類和魚類等各種脊椎動物中,廣泛存在著相應的病毒。目前研究得較廣泛和深入的還是那些與人類健康、畜牧業直接相關的脊椎動物病毒。常見的如流感病、麻疹、腮腺炎、肝炎、皰疹、流行乙型腦炎、艾滋病以及狂犬病等。此外,根據統計,在人類的惡性腫瘤中,約有15%是由于病毒的感染而誘發的。家禽和其他哺乳動物中的病毒病也相當普遍,如豬瘟、牛瘟、口蹄疫等。家禽中則有雞新城疫、雞瘟和雞的勞斯氏肉瘤等。
(4)昆蟲病毒 在病毒學領域內,昆蟲病毒的研究和開發工作起步較晚,但發展較快。據記載,當前國際上已報道的昆蟲病毒有1 671種(1990),我國有290多種(1990)。在昆蟲病毒中,80%以上是農林業中常見的鱗翅目害蟲的病原體。
大多數昆蟲可在宿主細胞內形成包含體。由于在光學顯微鏡下觀察,昆蟲病毒包含體一般呈多角狀,因此稱之為多角體(polyhedron)。多角體一般是外形呈多角狀的多面體,大小一般在0.5~10µm,多數約為3µm;多角體 成分為堿溶性結晶蛋白,其內包裹著數目不等的病毒粒子。包含體可在細胞核或細胞質內形成。
根據是否形成包含體,把昆蟲病毒分為包含體病毒和非包含體病毒。在包含體病毒中分為核型多角體病毒(NPV),在宿主細胞核內形成包含體和桿狀的病毒粒子;質型多角體病毒(CPV),在宿主細胞質中形成包含體和球狀病毒粒子;以及顆粒體病毒(GV),可在細胞核或細胞質中形成包含體和桿狀病毒粒子。
4.1.5 亞病毒的化學組成
前述的病毒有核酸成分和蛋白質成分。1970年發現了侵染性小分子RNA,1980年又發現了有侵染力的蛋白質分子。有人將這些侵染性分子稱亞病毒。
(1)類病毒 在美國工作的瑞士學者T.O.Diener 1971年發現馬鈴薯紡錘形塊莖病的病原是一種只有侵染性小分子RNA而沒有蛋白質的感染因子,他稱為類病毒(viroid)。類病毒是一個裸露的閉合環狀RNA分子,它能感染寄主細胞并在其中進行自我復制使寄主產生病癥。類病毒的分子量小,僅為最小RNA病毒的十分之一,約10萬Da。馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(PSTV)是研究得比較清楚的一種類病毒,它是一個長50nm的棒狀dsRNA分子,由2個互補的半體組成,一個含179個核苷酸,另一個含180個核苷酸,兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結合,共形成122個堿基對,整個棒狀結構中有27個內環,最大的螺旋含8個堿基對,最大的內環含12個核苷酸。類病毒對熱和脂溶劑有抗性,類病毒除了通過汁液摩擦傳染外,有些可以通過種子傳染或無性繁殖材料傳染,但沒有找到昆蟲和螨類媒體。
(2)擬病毒 如果把具有核酸和蛋白質組分的病毒稱為“真病毒”的話,擬病毒則是存在于植物“真病毒”的顆粒中的小的環狀RNA分子。澳大利亞人Randles在研究絨毛煙斑駁病毒(velvet tabacco virus mottle VTMoV)時發現,VTMoV的基因組除含有一種大分子線狀ssRNA外,還含有一種類似于類病毒的環狀ssRNA分子。這兩種RNA分別接種寄主時都不能感染和復制,只有把兩者合在一起時才能感染和復制。于是Haseloff等將這種包被于 病毒殼體內的環狀RNA分子稱為擬病毒,現已發現的擬病毒除絨毛煙斑駁病毒(VTMoV)外,還有莨菪斑駁病毒(SNMV),苜蓿暫時性條斑病毒(LTSV)和地下三葉草班駁病毒(SCMoV)。這4種擬病毒的RNA功能不完全相同。VTMoV、SNMV中的擬病毒是致侵染所必需的,而LTSV擬病毒的作用類似于衛星RNA,即病毒中大的線狀RNA可以單獨復制,而環狀的擬病毒RNA的復制則依賴于線狀大RNA。進一步的研究發現,SNMV的擬病毒RNA與LTSV的大線狀RNA一起接種時能夠復制,改變LTSV引起的癥狀,即在SNMV中作為基因組部分的擬病毒RNA,在LTSV中起衛星RNA的作用。
(3)朊病毒(又稱毒朊) 朊病毒是美國加州大學舊金山分校動物病毒學家Prusiner1982年研究羊的瘙癢病原時發現的一種對人有侵染性的蛋白質顆粒,稱為“Prion”(Protein infection的縮寫)或“Virino”,有人譯為“朊病毒”,或“毒朊”。這一發現使生物學家感到震驚,因為它與現行的生物中心法則即DNA→RNA→蛋白質的依賴關系背道而馳。由于這種病毒很奇特,有人又稱奇異病毒。尚未發現這種毒性蛋白質分子蘊藏有任何核酸,即使有,其堿基數太少,不足以編碼一個毒性蛋白分子。它除了引起羊瘙癢病外,還導致牛的海綿狀腦(即“瘋牛病”,或稱BSE)和人的苦魯。òl現于新幾內亞東部高原的一種中樞神經系統退化癥)等。令人吃驚的是,1996年在英國發現的BSE也可感染人類。
朊病毒在電鏡下呈桿狀顆粒,直徑25nm,長100~200nm(一般為125~150nm),桿狀顆粒不單獨存在,總是呈叢狀排列,其大小和形狀不一,有的叢含有多達100個桿狀顆粒。侵染性的朊病毒的單體含有3個或少于3個prp(proteinase-resistant protein)分子,而桿叢聚合體可能含多到105個prp分子,所測定的半感染劑量(ID50)介于10~100個桿之間。朊病毒的分子量為27~30Kda。提純的朊病毒用剛果紅染色,在光學顯微鏡下可以看到許多無定形結構,大小為1~20µm。
朊病毒的致病機理不太清楚,感染寄主后,蛋白質擴增研究發現,動物的某染色體上有一基因編碼與合成一種蛋白,非常類似于朊病毒蛋白,主要存在于神經細胞中。朊病毒蛋白在寄主蛋白合成中(或合成后)起修飾作用。它不是破壞寄主細胞的酶,而是使正常的寄主基因產生更多的致病蛋白質。
4.2 噬菌體
噬菌體(phage)是侵染細菌的微生物病毒,廣泛分布于自然界中。幾十年來人們對大腸桿菌T-系噬菌體進行了大量研究,獲得了很多有關病毒的基礎知識。雖然植物病毒在病毒學發展史上曾起過領先的作用,但要從分子水平上深入研究病毒復制增殖、生物合成、基因表達、顆粒裝配、感染性以及其他活性等問題,噬菌體卻是一個很方便的模型和獨特的工具,因為它是一個單細胞的宿主和很簡單的寄生物。
4.2.1 噬菌體的形態
與其他病毒一樣,噬菌體都是由蛋白質和核酸組成。核酸以單鏈或雙鏈分子組成環狀或線狀,病毒粒子外殼有不同形狀和大小。基本形態為蝌蚪形、微球形和線狀3種。從結構看又可以分為6種不同的類型,現將它們概括于表2-5。
4.2.2 噬菌體的生長周期
(1)噬菌體生長的測定——一步生長曲線 噬菌體繁殖和其他病毒一樣,其生活周期包括吸附、侵入、復制、組裝和釋放5個階段。
一步生長曲線 定量描述毒性噬菌體生長規律的實驗曲線稱為一步生長曲線。該種曲線反映出三個重要特征參數:潛伏期、裂解期、裂解量。一步生長曲線的實驗方法如下:先把在對數期生長的敏感細菌懸浮液與適量的噬菌體混合,通常噬菌體和細菌的混合比例為10:1,避免幾個噬菌體同時侵染一個細菌細胞。經數分鐘吸附后,混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清,以中和尚未吸附的噬菌體。然后再用培養液進行高倍稀釋,以免發生第二次吸附和感染。培養后定時取樣,將含噬菌體的樣品與敏感細菌混合,在平板上培養,計算噬菌斑數。結果可見,在吸附后的開始一段時間內(5~10min),噬菌斑數不見增加,說明噬菌體尚未完成復制和組裝,這段時間稱為噬菌體的潛伏期。緊接著在潛伏期后的一段時間(感染后20~30min),平板中的噬菌斑數突然直線上升,表示噬菌體已從寄主細胞中裂解釋放出來,這段時間稱為裂解期。每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數稱為裂解量。當宿主全部裂解,溶液中的噬菌體的效價達到最高點時稱為平穩期。
裂解量 =裂解期平均噬菌斑數/潛伏期平均噬菌斑數
殖過程
通常把毒性噬菌體看作噬菌體的正常表現。大腸桿菌T4噬菌體是一種毒性噬菌體,它是雙鏈DNA病毒,由二十面體的頭部和一個可收縮的尾部組成,尾部由中空的尾髓和可收縮的蛋白質尾鞘組成,尾端有6根尾絲。毒性噬菌體的入侵增殖一般包括吸附、侵入、復制、裝配、釋放等五個階段。
①吸附 噬菌體與敏感的寄主細胞接觸,在寄主細胞的特異性受點上結合。T4噬菌體是以尾部末端和寄主的受點吸附。一種細菌可被多種噬菌體感染,不同的感染噬菌體在同一寄主細菌的不同受點上吸附。因此,一個寄主細菌(例如大腸桿菌)與一種噬菌體(例如T4 )飽和吸附后, 并不防礙和另一種噬菌體(例如T6)再吸附。
②侵入 噬菌體吸附在細菌細胞壁的受點上以后,核酸注入細菌細胞中,蛋
白質殼體留在外面,從吸附到侵入的時間間隔很短,只有幾秒到幾分鐘。
③復制 噬菌體核酸進入寄主細胞后,操縱寄主細胞的代謝機能,大量復制噬菌體核酸,并合成病毒所需要的蛋白質,但不形成帶殼體的粒子。
④粒子成熟(裝配) 寄主細胞合成噬菌體殼體(T4噬菌體包括頭部、尾部),并組裝成完整的噬菌體粒子。
⑤寄主細胞的裂解(釋放) 噬菌體粒子成熟,引起寄主細胞的裂解,釋放出病毒粒子。噬菌體的釋放量隨種類而有所不同,一個寄主細胞可釋放10~10 000個噬菌體粒子。
在細菌培養液中,細菌被噬菌體感染,細胞裂解,混濁的菌懸液變成透明的裂解溶液。在雙層平板固體培養基上,稀釋的噬菌體懸液引起點狀感染,在感染點上進入反復的侵染過程,產生透明的空斑稱為噬菌斑。
3)溫和噬菌體和溶源性 有些噬菌體侵入寄主細菌后,并不像上述毒性噬菌體那樣發展,而是它們的核酸和寄主細胞同步復制,寄主細胞不裂解,這類噬菌體稱為溫和噬菌體。含有溫和噬菌體的寄主細胞稱為溶源細胞(或細胞溶源化),在溶源細胞內的噬菌體核酸稱為原噬菌體(或前噬菌體)。
溶源細胞(溶源細菌)正常繁殖時絕大多數不發生裂解現象,只有極少數(大約10-6)溶源細胞中的原噬菌體發生大量復制的現象,并接著成熟為噬菌體粒子,這時導致寄主細菌裂解,這種現象稱為溶源細菌的自發裂解。也就是說少數溶源細菌中的溫和噬菌體變成了毒性噬菌體。
檢驗溶源菌的方法是將少量溶源菌與大量敏感指示菌(易受溶源菌釋放出的噬菌體感染發生裂解性循環者)相混合,然后倒入營養瓊脂平板,溶源菌生長成菌落。當溶源菌中極少數的細胞發生自發裂解釋放出病毒粒子時,這些病毒粒子會感染溶源菌落周圍的敏感指示菌,并反復侵染形成噬菌斑。最后形成中央是溶源菌菌落,四周為透明裂解圈的特殊菌落。
溶源細胞的誘發裂解:用低劑量的紫外線照射處理,或其它物理、化學方法處理,能夠誘發溶源細胞大量潰溶,釋放出噬菌體粒子。
溶源細胞的復愈:溶源細胞有時消失了其中的原噬菌體,變成為非溶源細胞,這時既不會發生自然潰溶現象,也不發生誘發潰溶現象,稱為溶源細胞的復愈或非溶源化。溫和噬菌體侵入寄主細胞后可能發生的侵染過程見圖2-63。
λ型噬菌體 λ噬菌體是一種研究得透徹的大腸桿菌溫和噬菌體,λ噬菌體的原噬菌體插入寄主細胞的染色體的特定位點(在gal和bio基因之間),成為寄主細胞染色體的附加體,并隨寄主細胞復制、繁殖而傳代。含有λ原噬菌體的溶源細胞對于λ原噬菌體的毒性突變株有免疫性,也就是說毒性突變株對非溶源寄主有毒性,對溶源寄主(含有λ原噬菌體)卻沒有毒性。
PI型噬菌體 PI噬菌體也是一種溫和噬菌體,它和λ噬菌體有兩個明顯不同
的特征:一個是它的原噬菌體主要是獨立地存在于寄主細胞內,而不是染色體的附加體。另一個是當它插入染色體成為附加體時不是在某個位點上,而是能在許多位點上插入。
除噬菌體外,自然界還存在侵染其他微生物的病毒,包括真菌病毒(mycoviruses)、藻病毒(phycoviruses)、和原生動物病毒。至今發現的真菌病毒都是dsRNA病毒。而藻類病毒則都是dsDNA 病毒。它們可能被利用作為生物防治劑,控制真菌病和藻類。
(4)噬菌體的危害 在發酵工業和食品工業上,噬菌體給人類帶來的危害是污染生產菌種,造成菌體裂解,無法累積發酵產物,發生倒罐事件,損失極其嚴重。
①丙酮、丁醇發酵與噬菌體污染 丙酮、丁醇發酵與噬菌體污染可為發酵受害的典型代表。當受噬菌體感染,發酵速度緩慢、產氣減少、發酵液對流也不旺盛,甚至菌數減少,逐漸使發酵停止?梢圆捎檬删w抗性菌株,每隔一周交換使用一次,這樣對穩定生產有一定好處。
②抗生素發酵與噬菌體污染 灰色鏈霉菌發酵生產鏈霉素, 由于噬菌體污染出現溶菌現象,菌體減少,培養液變黑,抗生素效價不上升。1951年以來,有關金色鏈霉菌的噬菌體的報道,四環素發酵生產中也出現類似異,F象。
③食品工業上的噬菌體污染 食品工業上采用乳酸菌、醋酸菌、棒狀桿菌等進行發酵,生產各種不同的產品,如果生產過程中受到相應的噬菌體感染時,發酵作用就會減慢,周期明顯延長,甚至停止;發酵液變清,不積累發酵產物,菌體很快消失,整個發酵生產就被破壞。所以在微生物發酵工業中,必須采取一定預防措施以減少由噬菌體造成的損失。
要防治噬菌體危害,首先是提高有關人員的思想認識,建立“防重于治”的觀念。預防的措施主要有:a. 決不可使用可疑菌種。認真檢查搖瓶、斜面及種子罐所使用的菌種,堅持廢棄任何可疑菌種。b. 嚴格保持環境衛生。c. 決不排放或丟棄活菌液。嚴格消毒或滅菌后才能排放。d. 注意通氣質量?諝膺^濾器要保持質量并經常滅菌。e. 加強管道和發酵罐的滅菌。f. 不斷篩選抗性菌種,并經常輪換生產菌種。g. 嚴格執行會客制度。
預防不成,一旦發現噬菌體污染,要及時采取合理措施。例如:a. 盡快提取成品。b. 使用藥物抑制, 加入某些金屬螯合劑(如0.3~0.5%的草酸鹽、檸檬酸銨,可抑制噬菌體的吸附和侵入),抗生素,表面活性劑等。c. 及時改用抗噬菌體的生產菌株。
(5)噬菌體的應用
①用于細菌鑒定和分型 由于噬菌體的作用具有高度的種、型特異性,即一種噬菌體只能裂解和它相應的該種細菌的某一型,因此可用于細菌鑒定。目前已利用噬菌體將金黃色葡萄球菌分為132型,將傷寒桿菌分為72型。
②用于診斷和治療疾病 噬菌體感染相應細菌后,迅速繁殖并產生噬菌體子代。利用這一特性可將已知噬菌體加入被檢材料中,如出現噬菌體效價增長,就證明材料中有相應細菌存在。在疾病治療中可使用噬菌體來裂解細菌,特別是有些細菌對抗生素產生抗藥性,最好的辦法就是采用相應噬菌體來治療。
③用作分子生物學研究的實驗工具 由于噬菌體的基因數目少,噬菌體變異或遺傳性缺陷株又容易辨認、選擇和進行遺傳性分析,因此可以通過物理的或化學的方法誘變使其產生多種噬菌體的蝕斑型突變株和條件致死突變株,然后利用這些突變株的基因重組試驗,來研究噬菌體個別基因的排列順序和功能。在生物技術方面,噬菌體可作為載體,將核酸片段傳遞到另一細胞中,改變細胞的遺傳特性。現已被應用到遺傳工程上。
從1892年俄國科學家伊萬諾夫斯基發現煙草花葉病毒以后,牛口蹄疫病毒、人黃熱病毒、細菌病毒(即噬菌體)、昆蟲病毒相繼被發現。近年來,繼真菌病毒后又發現了藍綠藻病毒、支原體病毒等。隨著現代科學技術的發展,特別是超速離心機和電子顯微鏡等先進儀器的問世,對病毒的研究已進入了一個新階段。現已發現的各種病毒有3 600多種,它們廣泛分布在自然界中,無論動物、植物和人類都可受到病毒的危害。例如:由微生物引起的人類傳染性疾病,就有80%是由病毒所引起。病毒性疾病的重要特點是:傳染性高,流行面廣,有較高的死亡率。目前還發現許多腫瘤疾病也與病毒有關。因此,掌握病毒的特性,認識病毒的傳染和發病特點,對控制病毒帶給人類的危害,防止病毒對食品造成污染,以及減少發酵食品生產中因噬菌體污染而造成的損失均有一定的意義。
現在,病毒不僅是病毒學研究的對象,而且也成為分子生物學和分子遺傳學的主要研究對象,研究病毒對這兩門學科的發展產生了重大的影響。人們利用噬菌體對細菌作用的專一性,進行細菌分型鑒定或細菌病治療;在分子生物學研究中,它作為載體應用于遺傳工程上;在食品工業發酵生產中,噬菌體是造成生產菌種污染的因素之一。
4.1 病毒的形態結構及主要類群
4.1.1 病毒的基本特點
病毒比其它微生物結構更簡單,它是由蛋白質圍繞著核酸組成的復合分子構成的,為非細胞結構型,而且只有一種核酸,核酸構成病毒的基因組,病毒沒有完整的酶系統。
病毒不能在人工培養基上繁殖,必須進入活細胞中,依靠寄主細胞供給能量、養料、酶類等才能增殖,在寄主細胞內的增殖是以自我復制的方式形成新的病毒粒子。某些病毒的基因片段,也可以整合到寄主細胞核染色體的基因組中,并隨細胞DNA的復制而復制,引起潛伏感染。
在活細胞內生活的病毒,對于能干擾細胞代謝的各種因素具有明顯的抵抗力。如對甘油有耐受作用,不像細菌等微生物那樣可被甘油脫水而死亡,也能抵抗多種抗生素的作用,但干擾素可阻止它的生長和成熟。
4.1.2 病毒的形狀和大小
成熟的具有侵染力的病毒顆粒稱為病毒粒子(virion)。在電子顯微鏡下觀察到的病毒粒子一般為球狀、棒桿狀、蝌蚪狀和線狀等多種形態。人、動物和真菌的病毒大多呈球狀(如腺病毒、蘑菇病毒),少數為彈狀或磚狀(如彈狀病毒、痘病毒)。植物病毒和昆蟲病毒則多數為線狀和桿狀(如煙草花葉病毒、家蠶核型多角體病毒),少數為球狀(如花椰菜花葉病毒)。細菌病毒稱噬菌體(bacteriophage),部分呈蝌蚪狀(T2,T4,λ噬菌體),部分線狀(fd、M13等)或球狀(MS2、φX174等)(圖2-55)。
病毒個體用納米(nm)來量度。病毒的大小懸殊,直徑在10~300nm之間,通常在100nm左右。較大的病毒如痘類病毒,其大小為250~300nm×200~50nm,比最小的細菌支原體(直徑200~250nm)還大。最小的病毒如菜豆畸矮病毒,粒子大小僅為9~11nm,比血清蛋白分子(直徑22nm)還小。
病毒在寄主外存在時,只保留著在適宜條件下感染寄主的潛在能力。這種潛在的感染能力很容易變性失活。它對溫度很敏感,在55~60℃,病毒懸液幾分鐘內就變性。Χ-射線、γ-射線、紫外線照射都能使病毒變性失活,帶封套的病毒容易被脂肪溶劑破壞,無封套的病毒對多種常用的消毒劑的抗性較強。常用甲醛來消毒污染了病毒的器具和空氣。
由于病毒沒有細胞結構,不能在寄主細胞外面獨立復制,因而有的學者只把它們看成是一種遺傳成分,同質粒有所類似。
4.1.3 病毒的結構與化學組成
(1)病毒粒子的結構 病毒主要由殼體(capsid)和核酸二部分構成。殼體和核酸統稱為核殼(nucleo-capsid)。有些病毒在核殼外還有一層外套稱包膜(envelope),有的包膜上還有刺突(spike)。包膜由脂肪或蛋白組成。殼體的化學成分是蛋白質,由稱為殼粒(capsomer)的亞單位組成。殼粒是電鏡下能見的最小形態學單位,由一種或多種肽鏈折疊而成。
由于殼粒在殼體上的不同排列,病毒具有下列3種形態結構。
①螺旋對稱 具有螺旋對稱結構的病毒多數是單鏈RNA病毒,其粒子形態為線狀(如大腸桿菌噬菌體f1)、直桿狀(如煙草花葉病毒)和彎曲桿狀(如馬鈴薯X病毒)。這類病毒的殼體由殼粒一個挨一個地呈螺旋對稱排列而成,核酸位于殼體的螺旋狀結構中。煙草花葉病毒的桿狀殼體由2 130個殼粒螺旋狀排列而成,約有130個螺旋,螺距為2.35nm,殼體全長約300nm 。
②二十面體對稱 有些看起來好象球形的病毒粒子,經高分辨率電子顯微鏡觀察,實際上是個多面體。它們的核殼是由不同數量的殼粒按一定方式排列而成的立方對稱體。這些殼粒沿三根相互垂直的軸形成對稱體,殼體一般廿面體。廿面體具有20個面(每個面是一個等邊三角形),30條棱和12個頂角。腺病毒的殼體是這類結構的典型代表,它由252個球形的殼粒排列成一個廿面的對稱體。
③復合對稱 這類病毒的殼體是由兩種結構組成的,既有螺旋對稱部分,又有立方體對稱部分,故稱復合對稱,如大腸桿菌T4噬菌體。T4噬菌體如蝌蚪狀,其頭部外殼由8種蛋白質組成呈橢圓形20面體,含212個殼粒,核酸埋藏在蛋白質外殼中。T4噬菌體的尾部為螺旋對稱結構,含有兩種分子量較大的蛋白質和4種分子量較小的蛋白質,由144個殼粒組成排成棒狀,共分24個螺旋。尾部中央為尾髓,中空,是注射核酸的通道。除此之外,T4還有頸圈,基片,刺突和尾絲等附屬結構。
(2)病毒的化學組成 多數病毒只含蛋白質和核酸兩種成分。少數大型病毒還含有脂類和糖類。
①病毒蛋白 病毒一般只含一種或少數幾種蛋白。蛋白質在病毒中的含量隨病毒種類而異,如狂犬病毒的蛋白質含量約占整個病毒粒子的96%,而大腸桿菌T3、T4 噬菌體則只占40%。
病毒蛋白的氨基酸組成和其他生物一樣,但半胱氨酸和組氨酸在病毒蛋白中較少見。不同種病毒蛋白的氨基酸含量各不相同,大腸桿菌噬菌體M13的外殼蛋白只有49個氨基酸,煙草花葉病毒普通株的外殼蛋白有158個氨基酸,家蠶核型多角體病毒蛋白有244個氨基酸。病毒蛋白多數位于病毒顆粒的外層,包在核酸外面,以保護核酸免受破壞。有些病毒蛋白與吸附細胞受體有關(如流感病毒的血凝素等),有些則是一些酶,如噬菌體的溶菌酶、白血病病毒的DNA聚合酶、RNA腫瘤病毒的反轉錄酶等。它們在病毒的侵染和增殖過程中發揮作用。
②病毒核酸 病毒只含一類核酸(DNA或RNA),至今還沒發現一種病毒同時兼有兩類核酸。大多數植物病毒的核酸為RNA,少數為DNA;噬菌體的核酸大多數為DNA,少數為RNA;動物病毒,包括昆蟲病毒,則部分是DNA,部分是RNA。含DNA的病毒稱為DNA病毒,含RNA的病毒稱為RNA病毒。
無論是DNA還是RNA,都有單鏈(ss)和雙鏈(ds)之分。RNA病毒多數是單鏈,極少數為雙鏈,DNA病毒多數為雙鏈,少數為單鏈。病毒核酸還有線狀和環狀之分,如玉米條紋病毒的核酸為線狀單鏈DNA,大麗菊花葉病毒的核酸為閉合環狀雙鏈DNA。但RNA病毒核酸都呈線狀,罕見環狀。
此外,病毒核酸還有正、負鏈的區別。凡堿基排列順序與mRNA相同的單鏈DNA或RNA,稱(+)DNA鏈或(+)RNA鏈,凡堿基排列順序與mRNA互補的單鏈DNA和RNA,稱(-)DNA 鏈或(-)RNA鏈。如煙草花葉病毒的核酸屬于(+)RNA,副黏病毒的核酸為(-)RNA。正鏈(+)核酸具有侵染性,可直接作為mRNA合成蛋白質,負鏈(-)沒有侵染性,必須依靠病毒攜帶的轉錄酶轉錄成正鏈后才能作為mRNA合成蛋白質。
大部分病毒的遺傳物質為DNA,少數RNA病毒能以RNA為遺傳物質。病毒的核酸主要也由4種核苷酸組成。但病毒所含的核苷酸數比高等生物少得多,一般只含103~106個核苷酸。
有些RNA病毒的核酸分子還有分段現象。如流感病毒的核酸分為8個節段,每個節段都有自己獨特的核苷酸序列,分別轉錄一種蛋白質。有些分段核酸分散在不同的病毒顆粒中,如煙草脆裂病毒的核酸就分藏在兩種長短不一的顆粒中,長顆粒含2.5×106Da的RNA,有RNA復制基因,具有侵染性;短顆粒含0.6~7.3×106 Da的RNA,有蛋白質外殼基因。煙草脆裂病毒只有在長顆粒和短顆粒一起感染細胞時才能正常復制。
病毒的核酸含量隨病毒種類而異,通常在1%~50%之間。一般形態結構復雜的病毒,核酸含量較多,如結構簡單的新城疫病毒核酸含量不到1%,而結構復雜的T2噬菌體核酸含量超過50%,這是因為結構復雜的病毒需要較多的基因。
③脂類和糖類 少數有包膜的大型病毒含有蛋白質和核酸外,還含有脂類和糖類等其他成分。如大蚊紅色病毒含有5% 脂類,流感病毒除含19% 脂類外,還含有6% 的非核糖成分的糖類。
病毒所含的脂類主要是一些磷脂、膽固醇和中性脂肪,它們大多數存在于包膜中。病毒所含的糖,主要是葡萄糖、龍膽二糖、巖藻糖、半乳糖等。它們或以糖苷鏈直接與堿基相連,或以氨基酸殘基相連,以糖蛋白的形式存在。糖蛋白位于有包膜病毒的表面,已知它與血清反應有關。
④病毒的包含體 有些病毒在寄主細胞內還形成包含體的結構,它們多數位于細胞質內,具嗜酸性;少數位于細胞核內,具嗜堿性;也有細胞質和細胞核內都存在的類型。包含體是寄主細胞被病毒感染后形成的蛋白質結晶體,內含1個到幾個病毒粒子。包含體的個體較大,在光學顯微鏡下就能看到,包含體有多角形和顆粒形兩種,前者稱為多角形包含體,后者稱為顆粒狀包含體。顆粒狀包含體呈圓筒形或橢圓形,內含1個(偶爾2個)病毒粒子。多角形包含體一般呈六角形、五角形、四角形和三角形,內含多個病毒粒子。
4.1.4 病毒的主要類群
自從1892年伊萬諾夫斯基發現病毒以來,迄今已發現了3 600多種病毒。很多病毒學家對病毒的分類作了不懈的努力,探索了很多的途徑,提出 了大量的方案,但目前還不成熟,還不完善。人們仍然根據病毒對宿主感染的專一性,按宿主的不同將病毒分為微生物病毒、植物病毒、脊椎動物病毒和昆蟲病毒。
(1)微生物病毒 侵染細菌、放線菌等原核微生物的病毒,通常稱為噬菌體,微生物病毒廣泛存在于自然界中,在真菌、藍綠藻中也發現有病毒的感染。據報道,至今已作過電鏡觀察的噬菌體至少已有2 850種(株),其中2 700種(株)是有尾的,噬菌體在病毒學中以E.coli中發現的噬菌體最多,是研究最深入的。
(2)植物病毒 植物病毒大部分屬于ssRNA病毒,其基本形態有桿狀、絲狀和等軸對稱的近球狀二十面體,一般沒有包膜。只有少數種類才有包膜,例如植物彈狀病毒組的萵苣壞死黃化病病毒等。植物病毒雖是嚴格的細胞內寄生物,但是它們的專化性并不強,往往一種病毒可寄生在不同種、屬甚至不同科的植物上,例如TMV就可以傳染10多個科,100多種草本和木本植物。
已知的植物病毒多達600多種,絕大多數為種子植物,尤其是禾本科、葫蘆科、豆科、十字花科等植物都易發生病毒病。植物患病毒病后,主要出現三類癥狀:因葉綠體被破壞或不能合成新的葉綠素,而引起花葉、黃化或紅化等癥狀;植株發生矮化、叢枝或畸形等;形成枯斑或壞死等癥狀。
(3)脊椎動物病毒 在人類、哺乳動物、禽類和魚類等各種脊椎動物中,廣泛存在著相應的病毒。目前研究得較廣泛和深入的還是那些與人類健康、畜牧業直接相關的脊椎動物病毒。常見的如流感病、麻疹、腮腺炎、肝炎、皰疹、流行乙型腦炎、艾滋病以及狂犬病等。此外,根據統計,在人類的惡性腫瘤中,約有15%是由于病毒的感染而誘發的。家禽和其他哺乳動物中的病毒病也相當普遍,如豬瘟、牛瘟、口蹄疫等。家禽中則有雞新城疫、雞瘟和雞的勞斯氏肉瘤等。
(4)昆蟲病毒 在病毒學領域內,昆蟲病毒的研究和開發工作起步較晚,但發展較快。據記載,當前國際上已報道的昆蟲病毒有1 671種(1990),我國有290多種(1990)。在昆蟲病毒中,80%以上是農林業中常見的鱗翅目害蟲的病原體。
大多數昆蟲可在宿主細胞內形成包含體。由于在光學顯微鏡下觀察,昆蟲病毒包含體一般呈多角狀,因此稱之為多角體(polyhedron)。多角體一般是外形呈多角狀的多面體,大小一般在0.5~10µm,多數約為3µm;多角體 成分為堿溶性結晶蛋白,其內包裹著數目不等的病毒粒子。包含體可在細胞核或細胞質內形成。
根據是否形成包含體,把昆蟲病毒分為包含體病毒和非包含體病毒。在包含體病毒中分為核型多角體病毒(NPV),在宿主細胞核內形成包含體和桿狀的病毒粒子;質型多角體病毒(CPV),在宿主細胞質中形成包含體和球狀病毒粒子;以及顆粒體病毒(GV),可在細胞核或細胞質中形成包含體和桿狀病毒粒子。
4.1.5 亞病毒的化學組成
前述的病毒有核酸成分和蛋白質成分。1970年發現了侵染性小分子RNA,1980年又發現了有侵染力的蛋白質分子。有人將這些侵染性分子稱亞病毒。
(1)類病毒 在美國工作的瑞士學者T.O.Diener 1971年發現馬鈴薯紡錘形塊莖病的病原是一種只有侵染性小分子RNA而沒有蛋白質的感染因子,他稱為類病毒(viroid)。類病毒是一個裸露的閉合環狀RNA分子,它能感染寄主細胞并在其中進行自我復制使寄主產生病癥。類病毒的分子量小,僅為最小RNA病毒的十分之一,約10萬Da。馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(PSTV)是研究得比較清楚的一種類病毒,它是一個長50nm的棒狀dsRNA分子,由2個互補的半體組成,一個含179個核苷酸,另一個含180個核苷酸,兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結合,共形成122個堿基對,整個棒狀結構中有27個內環,最大的螺旋含8個堿基對,最大的內環含12個核苷酸。類病毒對熱和脂溶劑有抗性,類病毒除了通過汁液摩擦傳染外,有些可以通過種子傳染或無性繁殖材料傳染,但沒有找到昆蟲和螨類媒體。
(2)擬病毒 如果把具有核酸和蛋白質組分的病毒稱為“真病毒”的話,擬病毒則是存在于植物“真病毒”的顆粒中的小的環狀RNA分子。澳大利亞人Randles在研究絨毛煙斑駁病毒(velvet tabacco virus mottle VTMoV)時發現,VTMoV的基因組除含有一種大分子線狀ssRNA外,還含有一種類似于類病毒的環狀ssRNA分子。這兩種RNA分別接種寄主時都不能感染和復制,只有把兩者合在一起時才能感染和復制。于是Haseloff等將這種包被于 病毒殼體內的環狀RNA分子稱為擬病毒,現已發現的擬病毒除絨毛煙斑駁病毒(VTMoV)外,還有莨菪斑駁病毒(SNMV),苜蓿暫時性條斑病毒(LTSV)和地下三葉草班駁病毒(SCMoV)。這4種擬病毒的RNA功能不完全相同。VTMoV、SNMV中的擬病毒是致侵染所必需的,而LTSV擬病毒的作用類似于衛星RNA,即病毒中大的線狀RNA可以單獨復制,而環狀的擬病毒RNA的復制則依賴于線狀大RNA。進一步的研究發現,SNMV的擬病毒RNA與LTSV的大線狀RNA一起接種時能夠復制,改變LTSV引起的癥狀,即在SNMV中作為基因組部分的擬病毒RNA,在LTSV中起衛星RNA的作用。
(3)朊病毒(又稱毒朊) 朊病毒是美國加州大學舊金山分校動物病毒學家Prusiner1982年研究羊的瘙癢病原時發現的一種對人有侵染性的蛋白質顆粒,稱為“Prion”(Protein infection的縮寫)或“Virino”,有人譯為“朊病毒”,或“毒朊”。這一發現使生物學家感到震驚,因為它與現行的生物中心法則即DNA→RNA→蛋白質的依賴關系背道而馳。由于這種病毒很奇特,有人又稱奇異病毒。尚未發現這種毒性蛋白質分子蘊藏有任何核酸,即使有,其堿基數太少,不足以編碼一個毒性蛋白分子。它除了引起羊瘙癢病外,還導致牛的海綿狀腦(即“瘋牛病”,或稱BSE)和人的苦魯。òl現于新幾內亞東部高原的一種中樞神經系統退化癥)等。令人吃驚的是,1996年在英國發現的BSE也可感染人類。
朊病毒在電鏡下呈桿狀顆粒,直徑25nm,長100~200nm(一般為125~150nm),桿狀顆粒不單獨存在,總是呈叢狀排列,其大小和形狀不一,有的叢含有多達100個桿狀顆粒。侵染性的朊病毒的單體含有3個或少于3個prp(proteinase-resistant protein)分子,而桿叢聚合體可能含多到105個prp分子,所測定的半感染劑量(ID50)介于10~100個桿之間。朊病毒的分子量為27~30Kda。提純的朊病毒用剛果紅染色,在光學顯微鏡下可以看到許多無定形結構,大小為1~20µm。
朊病毒的致病機理不太清楚,感染寄主后,蛋白質擴增研究發現,動物的某染色體上有一基因編碼與合成一種蛋白,非常類似于朊病毒蛋白,主要存在于神經細胞中。朊病毒蛋白在寄主蛋白合成中(或合成后)起修飾作用。它不是破壞寄主細胞的酶,而是使正常的寄主基因產生更多的致病蛋白質。
4.2 噬菌體
噬菌體(phage)是侵染細菌的微生物病毒,廣泛分布于自然界中。幾十年來人們對大腸桿菌T-系噬菌體進行了大量研究,獲得了很多有關病毒的基礎知識。雖然植物病毒在病毒學發展史上曾起過領先的作用,但要從分子水平上深入研究病毒復制增殖、生物合成、基因表達、顆粒裝配、感染性以及其他活性等問題,噬菌體卻是一個很方便的模型和獨特的工具,因為它是一個單細胞的宿主和很簡單的寄生物。
4.2.1 噬菌體的形態
與其他病毒一樣,噬菌體都是由蛋白質和核酸組成。核酸以單鏈或雙鏈分子組成環狀或線狀,病毒粒子外殼有不同形狀和大小。基本形態為蝌蚪形、微球形和線狀3種。從結構看又可以分為6種不同的類型,現將它們概括于表2-5。
4.2.2 噬菌體的生長周期
(1)噬菌體生長的測定——一步生長曲線 噬菌體繁殖和其他病毒一樣,其生活周期包括吸附、侵入、復制、組裝和釋放5個階段。
一步生長曲線 定量描述毒性噬菌體生長規律的實驗曲線稱為一步生長曲線。該種曲線反映出三個重要特征參數:潛伏期、裂解期、裂解量。一步生長曲線的實驗方法如下:先把在對數期生長的敏感細菌懸浮液與適量的噬菌體混合,通常噬菌體和細菌的混合比例為10:1,避免幾個噬菌體同時侵染一個細菌細胞。經數分鐘吸附后,混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清,以中和尚未吸附的噬菌體。然后再用培養液進行高倍稀釋,以免發生第二次吸附和感染。培養后定時取樣,將含噬菌體的樣品與敏感細菌混合,在平板上培養,計算噬菌斑數。結果可見,在吸附后的開始一段時間內(5~10min),噬菌斑數不見增加,說明噬菌體尚未完成復制和組裝,這段時間稱為噬菌體的潛伏期。緊接著在潛伏期后的一段時間(感染后20~30min),平板中的噬菌斑數突然直線上升,表示噬菌體已從寄主細胞中裂解釋放出來,這段時間稱為裂解期。每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數稱為裂解量。當宿主全部裂解,溶液中的噬菌體的效價達到最高點時稱為平穩期。
裂解量 =裂解期平均噬菌斑數/潛伏期平均噬菌斑數
殖過程
通常把毒性噬菌體看作噬菌體的正常表現。大腸桿菌T4噬菌體是一種毒性噬菌體,它是雙鏈DNA病毒,由二十面體的頭部和一個可收縮的尾部組成,尾部由中空的尾髓和可收縮的蛋白質尾鞘組成,尾端有6根尾絲。毒性噬菌體的入侵增殖一般包括吸附、侵入、復制、裝配、釋放等五個階段。
①吸附 噬菌體與敏感的寄主細胞接觸,在寄主細胞的特異性受點上結合。T4噬菌體是以尾部末端和寄主的受點吸附。一種細菌可被多種噬菌體感染,不同的感染噬菌體在同一寄主細菌的不同受點上吸附。因此,一個寄主細菌(例如大腸桿菌)與一種噬菌體(例如T4 )飽和吸附后, 并不防礙和另一種噬菌體(例如T6)再吸附。
②侵入 噬菌體吸附在細菌細胞壁的受點上以后,核酸注入細菌細胞中,蛋
白質殼體留在外面,從吸附到侵入的時間間隔很短,只有幾秒到幾分鐘。
③復制 噬菌體核酸進入寄主細胞后,操縱寄主細胞的代謝機能,大量復制噬菌體核酸,并合成病毒所需要的蛋白質,但不形成帶殼體的粒子。
④粒子成熟(裝配) 寄主細胞合成噬菌體殼體(T4噬菌體包括頭部、尾部),并組裝成完整的噬菌體粒子。
⑤寄主細胞的裂解(釋放) 噬菌體粒子成熟,引起寄主細胞的裂解,釋放出病毒粒子。噬菌體的釋放量隨種類而有所不同,一個寄主細胞可釋放10~10 000個噬菌體粒子。
在細菌培養液中,細菌被噬菌體感染,細胞裂解,混濁的菌懸液變成透明的裂解溶液。在雙層平板固體培養基上,稀釋的噬菌體懸液引起點狀感染,在感染點上進入反復的侵染過程,產生透明的空斑稱為噬菌斑。
3)溫和噬菌體和溶源性 有些噬菌體侵入寄主細菌后,并不像上述毒性噬菌體那樣發展,而是它們的核酸和寄主細胞同步復制,寄主細胞不裂解,這類噬菌體稱為溫和噬菌體。含有溫和噬菌體的寄主細胞稱為溶源細胞(或細胞溶源化),在溶源細胞內的噬菌體核酸稱為原噬菌體(或前噬菌體)。
溶源細胞(溶源細菌)正常繁殖時絕大多數不發生裂解現象,只有極少數(大約10-6)溶源細胞中的原噬菌體發生大量復制的現象,并接著成熟為噬菌體粒子,這時導致寄主細菌裂解,這種現象稱為溶源細菌的自發裂解。也就是說少數溶源細菌中的溫和噬菌體變成了毒性噬菌體。
檢驗溶源菌的方法是將少量溶源菌與大量敏感指示菌(易受溶源菌釋放出的噬菌體感染發生裂解性循環者)相混合,然后倒入營養瓊脂平板,溶源菌生長成菌落。當溶源菌中極少數的細胞發生自發裂解釋放出病毒粒子時,這些病毒粒子會感染溶源菌落周圍的敏感指示菌,并反復侵染形成噬菌斑。最后形成中央是溶源菌菌落,四周為透明裂解圈的特殊菌落。
溶源細胞的誘發裂解:用低劑量的紫外線照射處理,或其它物理、化學方法處理,能夠誘發溶源細胞大量潰溶,釋放出噬菌體粒子。
溶源細胞的復愈:溶源細胞有時消失了其中的原噬菌體,變成為非溶源細胞,這時既不會發生自然潰溶現象,也不發生誘發潰溶現象,稱為溶源細胞的復愈或非溶源化。溫和噬菌體侵入寄主細胞后可能發生的侵染過程見圖2-63。
λ型噬菌體 λ噬菌體是一種研究得透徹的大腸桿菌溫和噬菌體,λ噬菌體的原噬菌體插入寄主細胞的染色體的特定位點(在gal和bio基因之間),成為寄主細胞染色體的附加體,并隨寄主細胞復制、繁殖而傳代。含有λ原噬菌體的溶源細胞對于λ原噬菌體的毒性突變株有免疫性,也就是說毒性突變株對非溶源寄主有毒性,對溶源寄主(含有λ原噬菌體)卻沒有毒性。
PI型噬菌體 PI噬菌體也是一種溫和噬菌體,它和λ噬菌體有兩個明顯不同
的特征:一個是它的原噬菌體主要是獨立地存在于寄主細胞內,而不是染色體的附加體。另一個是當它插入染色體成為附加體時不是在某個位點上,而是能在許多位點上插入。
除噬菌體外,自然界還存在侵染其他微生物的病毒,包括真菌病毒(mycoviruses)、藻病毒(phycoviruses)、和原生動物病毒。至今發現的真菌病毒都是dsRNA病毒。而藻類病毒則都是dsDNA 病毒。它們可能被利用作為生物防治劑,控制真菌病和藻類。
(4)噬菌體的危害 在發酵工業和食品工業上,噬菌體給人類帶來的危害是污染生產菌種,造成菌體裂解,無法累積發酵產物,發生倒罐事件,損失極其嚴重。
①丙酮、丁醇發酵與噬菌體污染 丙酮、丁醇發酵與噬菌體污染可為發酵受害的典型代表。當受噬菌體感染,發酵速度緩慢、產氣減少、發酵液對流也不旺盛,甚至菌數減少,逐漸使發酵停止?梢圆捎檬删w抗性菌株,每隔一周交換使用一次,這樣對穩定生產有一定好處。
②抗生素發酵與噬菌體污染 灰色鏈霉菌發酵生產鏈霉素, 由于噬菌體污染出現溶菌現象,菌體減少,培養液變黑,抗生素效價不上升。1951年以來,有關金色鏈霉菌的噬菌體的報道,四環素發酵生產中也出現類似異,F象。
③食品工業上的噬菌體污染 食品工業上采用乳酸菌、醋酸菌、棒狀桿菌等進行發酵,生產各種不同的產品,如果生產過程中受到相應的噬菌體感染時,發酵作用就會減慢,周期明顯延長,甚至停止;發酵液變清,不積累發酵產物,菌體很快消失,整個發酵生產就被破壞。所以在微生物發酵工業中,必須采取一定預防措施以減少由噬菌體造成的損失。
要防治噬菌體危害,首先是提高有關人員的思想認識,建立“防重于治”的觀念。預防的措施主要有:a. 決不可使用可疑菌種。認真檢查搖瓶、斜面及種子罐所使用的菌種,堅持廢棄任何可疑菌種。b. 嚴格保持環境衛生。c. 決不排放或丟棄活菌液。嚴格消毒或滅菌后才能排放。d. 注意通氣質量?諝膺^濾器要保持質量并經常滅菌。e. 加強管道和發酵罐的滅菌。f. 不斷篩選抗性菌種,并經常輪換生產菌種。g. 嚴格執行會客制度。
預防不成,一旦發現噬菌體污染,要及時采取合理措施。例如:a. 盡快提取成品。b. 使用藥物抑制, 加入某些金屬螯合劑(如0.3~0.5%的草酸鹽、檸檬酸銨,可抑制噬菌體的吸附和侵入),抗生素,表面活性劑等。c. 及時改用抗噬菌體的生產菌株。
(5)噬菌體的應用
①用于細菌鑒定和分型 由于噬菌體的作用具有高度的種、型特異性,即一種噬菌體只能裂解和它相應的該種細菌的某一型,因此可用于細菌鑒定。目前已利用噬菌體將金黃色葡萄球菌分為132型,將傷寒桿菌分為72型。
②用于診斷和治療疾病 噬菌體感染相應細菌后,迅速繁殖并產生噬菌體子代。利用這一特性可將已知噬菌體加入被檢材料中,如出現噬菌體效價增長,就證明材料中有相應細菌存在。在疾病治療中可使用噬菌體來裂解細菌,特別是有些細菌對抗生素產生抗藥性,最好的辦法就是采用相應噬菌體來治療。
③用作分子生物學研究的實驗工具 由于噬菌體的基因數目少,噬菌體變異或遺傳性缺陷株又容易辨認、選擇和進行遺傳性分析,因此可以通過物理的或化學的方法誘變使其產生多種噬菌體的蝕斑型突變株和條件致死突變株,然后利用這些突變株的基因重組試驗,來研究噬菌體個別基因的排列順序和功能。在生物技術方面,噬菌體可作為載體,將核酸片段傳遞到另一細胞中,改變細胞的遺傳特性。現已被應用到遺傳工程上。