（一）實驗目的：學習細菌的芽胞染色法

（二）實驗原理：細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。

（三）實驗器材

1.活材料：培養(yǎng)36小時的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）。

2.染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液[見附錄二（一）6、5]。

3.器材：小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、滴管、玻片擱架、接種環(huán)、擦鏡紙、鑷子、顯微鏡等。

（四）實驗方法

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法

（1）制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。

（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。

（3）加熱：將此試管浸于沸水浴（燒杯），加熱15—20min。

（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。

（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。

（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。

（7）復染：加蕃紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。

（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。

結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。

2.Schaeffer與Fulton氏染色法

（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細菌制成一薄的涂片。

（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。

（3）染色：

①加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干涸。（加熱時溫度不能太高）。

②水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。

③復染：用蕃紅液染色5min。

（4）水洗、晾干或吸干。

（5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。。

結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。

（五）實驗作業(yè)：

繪出所用材料的芽胞和菌體的形態(tài)圖。

（六）注意事項

1.供芽胞染色用的菌種應控制菌齡。

2.改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標本質(zhì)量等方面都較常規(guī)涂片法優(yōu)越，可優(yōu)先使用。

3.用改良法時，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應先用接種環(huán)充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。