SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法

　　　　GB/T 4789.6-2003 食品衛生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗

　　　　GB/T 4789.6-1994 食品衛生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗（已經作廢）

以SN標準方法為例，進行說明。

樣品制備：
　　以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質杯內,于8000 r/min均質1～2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。
　　稀釋樣品勻液根據對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。

　　附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法？

LST和EC初步篩選：
　　對每個樣品,選擇適宜的三個連續稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1℃培養48±2h。

　　觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,用直徑為3mm的接種環將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養48±2h。

　　附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？

EMB平板：

　　取其產氣管的培養物劃線接種于伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃培養24±2h。

　　檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

　　如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養瓊脂斜面上,36±1℃培養18～24h。

　　附：怎樣進行平板劃線分離？

　　　　平板劃線示例

　　　　EMB平板原理及照片

生化試驗：
　　將斜面培養物移種到下列培養基中進行生化試驗。　　
　　1　色氨酸肉湯：在36±1℃培養24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現紅色為靛基質陽性反應。

　　附：靛基質試驗原理及照片

　　2 MR-VP培養基：在36±1℃培養48±2h。以無菌操作移取培養物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現伊紅色,為VP試驗陽性。
　　將MR-VP培養物的剩余部分再培養48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。

　　附：MR-VP試驗原理及照片

　　3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養96h記錄有無生長。

　　附：枸椽酸鹽利用試驗原理及斜面顯色照片

　　4 LST肉湯：于36±1℃培養48±2h,觀察試管中是否產氣。
　　5　革蘭氏染色：取18h營養瓊脂斜面培養物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：

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　　靛 基 質┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定(型別)
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃典型大腸桿菌
　　　　－　┃ 　　＋　 　┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大腸桿菌
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中間型
　　　　－　┃　　 ＋ 　　┃ 　　－ 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中間型
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　　　　－　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型產氣腸桿菌
　　　　＋　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ 　＋ 　　　┃非典型產氣腸桿菌
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　　如出現上表以外的生化反應類型,表明培養物可能不純,應重新劃線分離,必要時做
重復試驗。

結果報告：

　　大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋－－或－＋－－,再根據LST肉湯陽性管數查MPN表,報告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。