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隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，新的細(xì)菌診斷技術(shù)和方法已廣泛用于食品微生物的鑒別。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學(xué)的研究。近年來國內(nèi)外學(xué)者不斷努力，已創(chuàng)建不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的細(xì)菌學(xué)診斷方法，尤其是DNA探針和多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，明顯提高了細(xì)菌的診斷水平。
一、快速酶觸反應(yīng)及細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測
快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來，并使得檢測結(jié)果直觀，正成為今后微生物檢測發(fā)展的一個主要發(fā)展方向。Rosa等將樣本直接接種于Granda培養(yǎng)基，經(jīng)18小時培養(yǎng)后，B群鏈球菌呈紅色菌落且可抑制其他菌的生長。
Delise等新合成一種羥基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的藍(lán)，將一定量的IBDG加入到麥康蓋培養(yǎng)基瓊脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培養(yǎng)18小時，出現(xiàn)深藍(lán)色菌落者為大腸埃希氏陽性菌株。其色彩獨特，且靛藍(lán)不易擴(kuò)散，易與乳糖發(fā)酵菌株區(qū)別。
二、免疫學(xué)方法檢測細(xì)菌抗原或抗體的技術(shù)
在細(xì)菌診斷中利用免疫學(xué)的各種方法日益受到人們的極大關(guān)注，從而簡化了病原微生物的鑒定手續(xù)。
1．抗血清凝集技術(shù)
早在1933年，Lancefield就成功地用多價血清對鏈球菌進(jìn)行了血清分型。隨著抗體制備技術(shù)的進(jìn)一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細(xì)菌凝集實驗的特異性，今天廣泛用于細(xì)菌的分型和鑒定，如沙門氏菌、霍亂弧菌等。
2．乳膠凝集實驗
將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過抗體與相應(yīng)的細(xì)菌抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。通常此法需獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物，再將培養(yǎng)物與致敏乳膠反應(yīng)。業(yè)已用于鑒定大腸桿菌O157；H7
3．熒光抗體檢測技術(shù)
用于快速檢測細(xì)菌的熒光抗體技術(shù)主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測，結(jié)果表明與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致。
4．協(xié)同凝集試驗（COA）
業(yè)已證實，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與人及各種哺乳動物IgG的Fc段結(jié)合的能力，而不影響抗體Fab段的活性。近年來國內(nèi)外學(xué)者采用抗體致敏的SPA檢測細(xì)菌即協(xié)同凝集試驗。如Rahman等用協(xié)同凝集試驗鑒定霍亂弧菌O1群的初代分離物做快速篩選，比常規(guī)法節(jié)省時間，對204份材料用兩種方法比較表明協(xié)同凝集試驗具有較高的特異性和敏感性。
5．酶聯(lián)免疫測試技術(shù)
酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了檢測的敏感性和特異性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用在病原微生物的檢驗。
應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀，是用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本，其優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。
三、分子生物學(xué)技術(shù)在檢測食源性病原微生物中的應(yīng)用
隨著分子微生物生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對病原微生物的鑒定已不再局限于對它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學(xué)水平上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立的眾多檢測技術(shù)中，核酸探針(Nuclear acid probe)和聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction)以其敏感、特異、簡便、快速的特點成為世人矚目的生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，業(yè)已逐步應(yīng)用于食源性病原菌的檢測。
1．核酸探針
將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標(biāo)記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認(rèn)識到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。
2．核酸探針的類型
根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據(jù)選用基因的不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應(yīng)，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA 發(fā)生雜交反應(yīng)，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測的基因相當(dāng)保守，包括大部分rRNA，因為他既可能在一種微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物。如應(yīng)用rRNA探針檢測作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli.選擇探針的原則是只能同檢測的細(xì)菌發(fā)生雜交反應(yīng)，而不受非檢菌存在的干擾。
3．核酸探針的應(yīng)用：
（1）．用于檢測無法培養(yǎng)，不能用作生化鑒定、不可觀察的微生物產(chǎn)物以及缺乏診斷抗原等方面的檢測，如腸毒素。
（2）．用于檢測同食源性感染有關(guān)的病毒病，如檢測肝炎病毒，流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分有毒和無毒菌株。
（3）．檢測細(xì)菌內(nèi)抗藥基因。
（4）．分析食品是否會被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。
（5）．細(xì)菌分型，包括rRNA分型。
4、核酸探針的特點:
4.1.探針的特異性:探針檢測技術(shù)的最大優(yōu)點是特異性，就是說一個適當(dāng)組建的DNA探針能絕對特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應(yīng)。對食品檢測而言，就是不與樣品中內(nèi)源性雜菌和樣品自身DNA發(fā)生非特異性反應(yīng)。
以往檢測方法檢測的是基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物）。檢測這種物質(zhì)受多種因素影響。比如食品中微生物因受應(yīng)激損傷（高溫、冷凍、化學(xué)制劑等）會導(dǎo)致基因組的變化，從而引起其表達(dá)產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測的是基因本身，它能識別基因本身的變異，不受基因表達(dá)產(chǎn)物的影響。常規(guī)免疫學(xué)方法檢測抗原、抗體，它們都是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影響發(fā)生變異，就會導(dǎo)致其產(chǎn)物的變化，影響抗原抗體間的反應(yīng)，使檢測特異性下降。
檢測病毒主要通過組織培養(yǎng)后，檢測病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)囊膜，即使采用超低溫保存，有時也會引起編碼蛋白質(zhì)囊膜基因的變化，而采取DNA探針檢測病毒則不用改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而只需檢測是否有相應(yīng)特異性的編碼蛋白質(zhì)囊膜的病毒靶DNA序列。
另外，核酸之間的識別連接比抗原抗體準(zhǔn)確，并且探針檢測比免疫學(xué)方法靈活。盡管看來形成抗原抗體復(fù)合物比核酸雜交快，但能通過加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，從而提高反應(yīng)速度，核酸比蛋白質(zhì)耐受高溫（100℃）、有機(jī)溶劑、螯合劑和高濃度工作液的破壞能力強(qiáng)，所以用比提取制備蛋白質(zhì)強(qiáng)烈的多的方法制備核酸，不會影響雜交反應(yīng)。當(dāng)然RNA探針除外，因為RNA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測用RNA。
核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件，如在不嚴(yán)格的條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結(jié)合力比嚴(yán)格條件下穩(wěn)定。
探針長度也會影響反應(yīng)的特異性，一般加Formamide增強(qiáng)反應(yīng)特異性。
4．2．探針的敏感性
研制核酸探針是為了檢測出單個病毒和細(xì)菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標(biāo)記系統(tǒng)。32P標(biāo)記物通常可檢出10-8摩爾特異DNA片段，相當(dāng)于0。5pg,1000個堿基對的靶系列，相當(dāng)于1000---10000個細(xì)菌。用親和素標(biāo)記探針檢測1小時培養(yǎng)物DNA含量在110pg，兩者敏感性大致相同，而血清學(xué)方法只能達(dá)到1ng的水平。
延長培養(yǎng)時間，增強(qiáng)信號強(qiáng)度能提高探針的敏感性。
非放射性物標(biāo)記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附，比放射性物標(biāo)記探針背景干擾小。
制備食品樣品時，因機(jī)械均漿而導(dǎo)致菌體破裂，產(chǎn)生較高的背景干擾會影響檢測敏感性。
在探針上加生物素化的核苷酸長尾能使檢測敏感性提高10倍。
細(xì)胞中rRNA比DNA多，檢測rRNA的探針比DNA敏感。通過擴(kuò)增DNA含量也能提高檢測敏感性。
4．3．探針檢測技術(shù)中存在的問題
檢測一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測速度快，但要達(dá)到檢測量還要對樣品進(jìn)行一定時間的培養(yǎng)，任何一種方法不可能有100%的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽性和假陰性的問題。
DNA探針還不能完全取得常規(guī)檢驗提供的細(xì)菌特性的信息，如在菌株生物型鑒定、血清型和抗藥基因上有不足之處。
檢測食品時，樣品中待檢菌量低雜質(zhì)成分復(fù)雜，樣品DNA純度不夠高等都會限制探針檢測的敏感性。
探針檢測是分析基因序列，對毒素污染的食品有時因樣品中不含產(chǎn)毒菌而無法檢測，因為盡管探針能檢測活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能檢測其表達(dá)產(chǎn)物，所以在評價食品安全衛(wèi)生上存在一定的局限性。
5．核酸探針雜交技術(shù)原理
根據(jù)完成雜交反應(yīng)所處介質(zhì)的不同，分成固相雜交反應(yīng)和液相雜交反應(yīng)。固相雜交反應(yīng)是在固相支持物上完成的雜交反應(yīng)，如常見的印跡法和菌落雜交法。事先破碎細(xì)胞使之釋放DNA/RNA然后把裂解獲得的DNA/RNA固定在硝基纖維素薄膜上，再加標(biāo)記探針雜交，依顏色變化確定結(jié)果，該法是最原始的探針雜交法容易產(chǎn)生非特異性背景干擾。
液相雜交法指雜交反應(yīng)在液相中完成，不需固相支持，優(yōu)點是雜交速度比固相雜交反應(yīng)速度快5�10倍。缺點是為消除背景干擾必需進(jìn)行分離以除去加入反應(yīng)體系中的干擾劑。
分離雜交DNA探針的方法有兩種，一種用羥磷灰石，它僅能與雙股DNA結(jié)合，單股DNA在和羥磷灰石結(jié)合前必須先同一個探針或互補(bǔ)單鏈雜交成雙股DNA才可。當(dāng)溶液中DNA通過羥磷灰石柱子時，只有雙股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脫下來，最后用激活的標(biāo)記物檢測。另一種分離方法運用磁球技術(shù)把探針與小磁球連接，再用多核苷酸尾部連接第二探針，不用離心就能分離DNA與未雜交DNA。短寡核苷酸能和磁球連接，也能從磁球上洗脫，在以mRNA系統(tǒng)進(jìn)行靶循環(huán)的檢測過程中，該方法能將背景干擾降低2---3個數(shù)量級，從而達(dá)到較高的敏感性。
5．1．夾心雜交法（Sandwish hybridization）
它由三種不同作用的核酸成分組成：（1）：與固相支持物連接的捕獲探針；（2）產(chǎn)生信號的檢測探針；（3）靶核酸序列。靶核酸在這個體系中起連接捕獲探針和信號檢測探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能于上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質(zhì)后能得到一個清晰的檢測信號，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號探針無法連接在固相物上，洗脫后固相物上無信號應(yīng)答。
5．2．核酸置換雜交分析法 （Strand displacement assay）
它是在夾心雜交法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的一種方法。先獎捕獲探針連接在固相物上，然后在此探針上以微弱的結(jié)合方式雜交一個短小能產(chǎn)生信號的核酸，如果靶DNA能與捕獲探針雜交可通過競爭置換出帶信號的核苷酸片段，在檢測過程中產(chǎn)生信號的單股核酸可轉(zhuǎn)化為ATP，再加入熒光素酶，用生物發(fā)光分析法檢測。其優(yōu)點在于背景干擾小，敏感性強(qiáng)。缺點為不是所有捕獲探針都能應(yīng)用這種方法雜交，且信號探針會不斷地從捕獲探針上脫落。
5．3．浸染棒法 （Dipstick assay）
它是夾心雜交法最新的一種改進(jìn)方法。它用兩種探針，其中一個進(jìn)行標(biāo)記，另一個是單核苷酸長鏈，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹與多聚腺苷酸長鏈探針能互補(bǔ)配對的堿基成分，即多聚胸腺嘧啶，盡管雜交反應(yīng)在溶液中完成，但浸染棒是完成最后檢測的固相支持物。它比薄膜法能更有效地減少背景干擾，提高檢測效率。亦已用于沙門氏菌和李氏菌的檢測。對熒光素標(biāo)記探針可用辣根過氧化物酶標(biāo)記熒光素抗體，通過比色法檢測復(fù)合物濃度。
6.聚合酶技術(shù)（PCR）的原理及其發(fā)展
6．1．PCR技術(shù)原理
為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴(kuò)增，增加DNA數(shù)量，使其達(dá)到足夠的檢測量，若反應(yīng)以動力學(xué)為基礎(chǔ)，則能定量分析。1983年Millus 和Cetus發(fā)明了最基本的擴(kuò)增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法·聚合酶鏈反應(yīng)即PCR法。PCR法建立在三步重復(fù)發(fā)生反應(yīng)的基礎(chǔ)上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應(yīng)。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補(bǔ)對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA，成為下次PCR復(fù)制的模板。因此每次循環(huán)特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴(kuò)增經(jīng)過20�40次循環(huán)能引起100萬倍的擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中引入Taq聚合酶使反應(yīng)得以半自動化和簡便反應(yīng)程序。用擴(kuò)增DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)具有無與倫比的優(yōu)越性。如用同位素標(biāo)記兩種基因（Lac Z 和 Lam B）的，探針做PCR反應(yīng)檢測水源中E.Coli，檢測量達(dá)到1�5 個細(xì)菌/100ml。為快速準(zhǔn)確的檢測食品中污染的病原微生物帶來一線曙光。
當(dāng)然PCR也存在缺點，主要是系統(tǒng)容易受外源DNA的污染，并隨樣品中待檢DNA一起擴(kuò)增。特別是1990年Bottger發(fā)現(xiàn)某些Taq聚合酶被外源性DNA物質(zhì)污染。另外試驗中需要一定的特殊設(shè)備和熟練的操作技術(shù)，尚不能全自動化，需要花勞力制備待檢樣品。
6．2．Qβ復(fù)制酶法
Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ復(fù)酶系統(tǒng)擴(kuò)增法。這種命名是根據(jù)反應(yīng)過程中起擴(kuò)增作用的酶來確定的。通過探針與靶DNA相結(jié)合，系統(tǒng)以酶學(xué)方法促進(jìn)擴(kuò)增。該探針是含有一個模板區(qū)域的RNA探針，其三級結(jié)構(gòu)稱作MDV1。系統(tǒng)含有RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶、Qβ和復(fù)制酶。擴(kuò)增MDV-1的速度很快。每循環(huán)一次需15-20秒，共循環(huán)15-30分鐘。千分之一含量的RNA可擴(kuò)增到125-200ng，一億倍擴(kuò)增。由于大量合成RNA，用簡單的比色法就能檢測雜交反應(yīng)。反應(yīng)呈動力學(xué)特征，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定初始結(jié)合物濃度，就可做定量分析。缺點是酶易受污染，導(dǎo)致敏感性下降，背景干擾限制了方法的實際應(yīng)用。
6.3．連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)法（Lar）
Lar是在PCR基礎(chǔ)上的又一種改進(jìn)，同PCR不同之處在于它不擴(kuò)增單個核苷酸形成DNA分子，而是用一種稱作T4DNA連接酶把兩個寡核苷酸彼此相連。通過連接酶的作用，兩者能相互交聯(lián)，在這種情況下，同PCR反應(yīng)一樣，連結(jié)的寡核苷酸沿原始系列排列，并成為下次循環(huán)的模板。循環(huán)20-30次可把原始靶DNA含量增加100萬倍。但它需對整個靶DNA序列事先有明確了解，否則一個堿基錯配就會導(dǎo)致寡核苷酸相互連結(jié)的失敗。
6.4．轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)（TAS/3SR/NASBATM）
1989年Kwoh等介紹了一種新技術(shù)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)（TAS），它是包括DNA合成和RNA轉(zhuǎn)錄的雙重循環(huán)過程。它以變性DNA和一般RNA為引物的寡核苷酸靶序列，這個寡核苷酸上包含多聚酶結(jié)合部和與靶序列互補(bǔ)配對的片段。雜交時，引物與靶序列結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物與靶序列互相配對，熱變性后，另外一個寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生與新股DNA互補(bǔ)的雙股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一個靶序列上。加入RNA聚合酶，可以擴(kuò)增RNA的拷貝數(shù)（10-1000）。因此方法僅需4次循環(huán)就能得到RNA分子1,000,000個拷貝數(shù)。
1990年Gualelli修正了TAS法，設(shè)計了一種稱作自我片段復(fù)制擴(kuò)增系統(tǒng)（3SR）。3SR與TAS不同之處在于，3SR是等溫反應(yīng)（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初變性這一步，3SR方法還是需要擴(kuò)增DNA，RNaseH用于降解在TAS反應(yīng)中形成的RNA-DNA雜合物，并轉(zhuǎn)化成雙股DNA。在雙股DNA的每一末端都含有一個聚合酶結(jié)合部，雙股DNA繼續(xù)循環(huán)并作為合成RNA的模板，再次參加反應(yīng)過程。15分鐘就能放大100，000個拷貝。而PCR法即使有100%擴(kuò)增效果也需要85分鐘才能取得同樣結(jié)果。
與PCR相比它不用熱循環(huán)，因此不必調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，所有反應(yīng)在一個反應(yīng)管中完成。另外3SR能區(qū)分DNA和RNA，同其它擴(kuò)增反應(yīng)一樣，3SR易受外源核酸的污染。由于反應(yīng)所需的酶多，并且與其它方法相比，反應(yīng)嚴(yán)格性低，所以特異性較差。
1989年Cangene發(fā)明了核酸片段擴(kuò)增法（NASBMTM），此法已獲得歐洲專利。據(jù)報導(dǎo)它能將100個分子的DNA擴(kuò)增到100ug。
6.5．放大信號檢測法
放大信號同時能改善DNA探針的敏感性。有些學(xué)者研究處用腺嘌呤酯標(biāo)志DNA的生物化學(xué)檢測方法，反應(yīng)初始時需加入H2O2，酯結(jié)構(gòu)的破壞會產(chǎn)生光，光亮強(qiáng)度與存在的靶DNA含量成比例關(guān)系，也有人用一種稱作磷酸苯二氧化物做生物發(fā)光劑，有報導(dǎo)稱，此物質(zhì)在堿性磷酸酶作用下轉(zhuǎn)化為發(fā)光物質(zhì)，用比色法檢測它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介紹了用化學(xué)顯影學(xué)致敏劑作為標(biāo)記物，加熱后，能釋放出光，用固相薄膜檢測能增加敏感性，生物化學(xué)發(fā)光法在DNA探針檢測上效果很好。
最近推崇非同位素的標(biāo)記物是酶標(biāo)抗體。標(biāo)記抗體能與共價結(jié)合的DNA探針標(biāo)記物相結(jié)合。如在探針尿嘧啶殘基上標(biāo)記熒光素，再用高度親和力的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗熒光素抗體檢測原始探針。胞嘧啶磺化物或在鳥嘌呤上引入2-乙酰氨基熒光素及其衍生物也能替代熒光素和酶連結(jié)抗體。
另一種途徑是把非活性的S-肽從核糖核酸酶上連結(jié)到DNA探針上，雜交后，加入S-蛋白，可重新構(gòu)建功能酶。再循環(huán)酶放大系統(tǒng)中檢測活化的核糖核酸酶。
現(xiàn)又研究出一種新方法，它是把探針切成兩半，每半標(biāo)記兩種不同的能相互聯(lián)結(jié)的熒光物質(zhì)或酶系統(tǒng)成分中的一種。當(dāng)兩種探針雜交相互靠近時，激活能量狀態(tài)的熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)移到鄰近的熒光物質(zhì)或酶系統(tǒng)受體上，而激活受體產(chǎn)生信號。反應(yīng)過程不用進(jìn)行分離，因為若沒有發(fā)生雜交反應(yīng)，兩種成分不能相互靠近，不會產(chǎn)生檢測信號。
7.分子生物學(xué)技術(shù)在食源性病原菌檢測上的應(yīng)用：
7.1.沙門氏菌
食品中沙門氏菌污染量小，常受應(yīng)激損傷，不易恢復(fù)，現(xiàn)用檢測方法得到陰性報告最少需四天，陽性報告還要延遲2-3天。研究檢測沙門氏菌的探針難度大，因為它擁有2000多個血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子。Fillal等人從染色體序列和構(gòu)建的質(zhì)粒文庫中分離到一個適用于沙門氏菌檢測的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應(yīng)。這種用同位素標(biāo)記的探針，能識別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有1個細(xì)菌/25克樣品，所以需要增菌培養(yǎng)。
AOAC最近認(rèn)可了Gene-Tark沙門氏菌比色分析法。這種探針標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過氧化酶標(biāo)記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門氏菌的特異性檢出率為100%，假陽性率為0.8%（BAM/AOAC培養(yǎng)法假陽性率是2.2%。）
7.2李斯特桿菌
1981年首次確定它是一種食源性病原菌，1985年加尼福利亞發(fā)生爆發(fā)性流行，現(xiàn)用檢測方法大多采用冷增菌，費時費力。
FDA于1987年最新研制出針對李斯特菌致病基因β�溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測李斯特菌的DNA探針，它能特異性識別細(xì)菌的16SrRNA。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測樣品需先在LEB中培養(yǎng)16�22h，然后侵染比色檢測，假陰性率為0.8�4.7%（常規(guī)法為1.4�2.9%。）
1989年Bessesea等運用擴(kuò)增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法檢測單核細(xì)胞增生型李斯特菌，DNA檢測量低于25ng，即少于1000個菌體，特異性強(qiáng)，能檢測出50株不同的單核李斯特菌，而不與12株非單核李斯特菌和12種非李斯特菌屬的細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)。
7.3.弧菌
關(guān)于用DNA探針檢測溶血性弧菌中溶血基因的報導(dǎo)很多。國外對DNA探針和單克隆抗體法在檢測鞭毛抗原方面作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA探針法陽性檢出率高。近年來用PCR擴(kuò)增DNA片段，再做探針檢測，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測敏感性為10個細(xì)菌/克，但要用凝膠電泳進(jìn)一步鑒定。因此，不太合適檢測食品。1989年Olive構(gòu)建了一個熱穩(wěn)定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測付溶血弧菌。
7.4.志賀氏菌
目前志賀氏菌檢測方法存在著質(zhì)粒容易丟失和受內(nèi)源菌干擾的問題。用核酸探針檢測可克服上述缺陷。現(xiàn)采用人工合成32P標(biāo)記的寡核苷酸探針在固定薄膜上做菌落雜交檢測志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC），也有人用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測志賀氏菌和（EIEC）。PCR擴(kuò)增前需將福氏痢疾菌擴(kuò)增培養(yǎng)到10000個/ml，增菌后檢測需6�7小時才能得到結(jié)果。敏感性為≤1個細(xì)菌/克。但PCR擴(kuò)增后需做凝膠電泳進(jìn)一步鑒定，對常規(guī)檢測來講太繁瑣。
7.5．耶爾森氏菌
Hill等研制出針對同耶爾森氏菌侵襲性質(zhì)粒有關(guān)的DNA探針。用菌落雜交法對人工污染食品所做試驗敏感性明顯地受內(nèi)源菌的影響。近年來，有人人工合成了一個24bp的寡核苷酸探針。它是針對侵襲性質(zhì)粒DNA中一部分的探針，用它檢測各種食品中耶爾森氏菌，發(fā)現(xiàn)，盡管無法區(qū)分無毒菌株且檢測限量不理想，但能檢測出10000－100000個細(xì)菌/克樣品。樣品中內(nèi)源性細(xì)菌對試驗方法沒干擾。1989年Feng.P等研制針對由染色體編碼的耶爾森氏菌侵襲性基因的DNA探針。
7.6.彎曲桿菌
檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標(biāo)記的。標(biāo)記物為發(fā)光素。靶順序為rRNA。近來用堿性磷酸酶標(biāo)記人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為100000個菌落形成單位（CFU），敏感性和特異性達(dá)100%。
探針對空腸彎曲桿菌的最低檢測量為20000至800000個活菌。由于糞便成分復(fù)雜，影響敏感性，此方法只在臨床檢測中應(yīng)用，尚未用于食品檢測。
7.7.葡萄球菌
大多數(shù)檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關(guān)的基因序列雜交，這類探針能檢測腸毒素A、B、C和E。
最近，GeneTark推出檢測金黃色葡萄球菌的探針，能半定量樣品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的認(rèn)可。方法采用侵染棒比色法，探針檢測的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假陽性率為9.3%，人工污染樣品中沒有假陽性結(jié)果發(fā)生。
7.8.假單胞菌屬
亦已研制出能檢測從肉品中分離到的DNA基因序列相似的假單胞菌的DNA探針。
7.9.大腸桿菌
大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Gene�Tark研制出用侵染棒檢測大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記探針，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗FITC抗體檢測雜交復(fù)合物。Hsu等報導(dǎo)方法特異性（除相近的志賀氏菌外）達(dá)100%，假陽性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）。
七十年代人們認(rèn)識到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作為糞便污染的指示菌。用DNA探針檢測大腸桿菌腸毒素于1984年得到AOAC的認(rèn)可。近來研究出用PCR法檢測不耐熱腸毒素的方法，它可以編碼不耐熱腸毒素基因序列為引物，用PCR法擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段，不擴(kuò)增耐熱腸毒素基因。檢測量為20個E.coli/100ul。Sander等構(gòu)建了一個能檢測產(chǎn)生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大腸桿菌GUD（β�葡萄糖醛酸酶）基因的探針，GUD是AOAC認(rèn)可的MUG（4�甲基傘形酮�β� D�葡萄糖醛酸），試驗中檢測的酶，現(xiàn)用PCR法擴(kuò)增GUD基因，再用DNA探針雜交。MUG試驗（即MUG在GUD作用下釋放出4�甲基�7�羥香豆素，它在長波紫外光照射下產(chǎn)生蘭色熒光）存在的問題是大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)有MUG陰性分離物，包括大腸桿菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探針證實GUD基因存在于所有大腸桿菌，包括O157：H7和志賀氏菌菌株中。MUG陰性菌株是由于GUD活性受到分解代謝產(chǎn)物的抑制。Kaspar等報導(dǎo)GUD抗體能和3/4MUG陰性菌株的提取物反應(yīng)。這表明某些菌株是能產(chǎn)生GUD的，但沒有活性，這可能是因為底物無法進(jìn)入某些菌株細(xì)胞內(nèi)或產(chǎn)物（4�甲基�7�羥香豆素）不能釋放到外界中。因此使用GUD探針檢測E.coli比MUG試驗準(zhǔn)確。
7.10.病毒
每年因病毒引起的食物中毒約占2�12%，如1982年Norwalk病毒引起美國5000人患腸胃炎，此外凸隆病毒、柯薩奇病毒、萼狀病毒和細(xì)小病毒也都能引起爆發(fā)性腸胃炎。很久以來人們就發(fā)現(xiàn)食品中存在致病性病毒，但對它們的檢測方法報導(dǎo)甚少。
食品中病毒檢測與臨床病毒檢測不同。因為每克糞樣中約含幾千萬個病毒粒子，而食品中僅有一個病毒粒子就會引起疾病。盡管如此，要造成對人的危害，尚需攝入成千上萬的病毒粒子。為保證人類健康，更精確評價病毒污染食品的程度，只有用DNA探針技術(shù)才能實現(xiàn)這一目的。
對市售食品中病毒種類尚缺乏足夠的研究，大部分學(xué)者只注重對腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究，其它病毒因方法問題尚未詳細(xì)報導(dǎo)。即便食品中含有病毒，由于它們數(shù)量少，難以從樣品中分離和在細(xì)胞上復(fù)制，實際上低估了食品中病毒的種類。目前的檢測方法，需要把病毒沉淀，在細(xì)胞和動物上復(fù)制驗證。DNA探針技術(shù)已用于檢測凸隆病毒、腺病毒和細(xì)小病毒，但還沒有用在食品檢測上。很難獲得足夠數(shù)量的病毒粒子大大限制了DNA探針技術(shù)在檢測病毒上的應(yīng)用。空斑雜交技術(shù)缺乏足夠的敏感性，而且需事先用PCR擴(kuò)增DNA片段，它只能用于檢測純培養(yǎng)的病毒。
FDA用合成的DNA探針檢測因食用貝類食品引起腸炎患者糞樣中的細(xì)小病毒，還用DNA探測環(huán)境樣品中的甲肝病毒。但尚未發(fā)現(xiàn)用探針檢測Norwalk病毒的報導(dǎo)。
四、病原微生物的自動化系統(tǒng)
近年來，隨著計算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，對病原微生物的鑒定技術(shù)朝著微量化、系列化、自動化的方向發(fā)展，從而開辟了微生物檢測與鑒定的新領(lǐng)域。最有代表性的是AMS微生物自動分析系統(tǒng)。
AMS為美國VITEK廠產(chǎn)品，屬于自動化程度高的儀器，由7個部件組成應(yīng)用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進(jìn)行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。
操作時，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細(xì)菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計算機(jī)所接受的生物編碼。最后由計算機(jī)判定，打印出鑒定結(jié)果。
該套系統(tǒng)檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應(yīng)指標(biāo)，基本同常規(guī)檢測鑒定，檢測所需時間4�8小時，最長不超過20小時。
