定期移植法

   

亦稱傳代培養保藏法，包括斜面培養、穿刺培養、液體培養等。是指將菌種接種于適宜的培養基中，最適條件下培養，待生長充分后，于4～6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養的菌種保藏方法。

操作步驟如下：

1 培養基制備

1.1 器皿準備

培養基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養皿、燒杯、吸管等，經洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

1.2 溶解培養基配料

先在燒杯中放適量水，按培養基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。

1.3 調pH值

配料溶解后將培養基冷卻至室溫，根據要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養成分被破壞。

1.4 加凝固劑

配制固體培養基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發水分。

1.5 過濾分裝

在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養基趁熱過濾并分裝。斜面培養基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

1.6 包扎標記

將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養基名稱及配制日期。

1.7 滅菌

根據要求將培養基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。

1.8 斜面擺放

滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。

1.9 無菌檢查

將滅菌的培養基放入培養箱中作無菌檢驗，通常30℃培養1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。

2.接種

2.1 斜面接種

2.1.1 點接

把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央劃線

從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。

2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。

2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。

2.1.5 挖塊接種法

挖取菌絲體連同少量培養基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。

2.2 穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。

2.3 液體接種

挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養基中。

3.培養

將接種后的培養基放入培養箱中，在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30～37℃，真菌培養溫度一般為25～28℃。

4. 保藏

培養好的菌種于4～6℃保存，根據要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。

保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。

斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和污染造成損失。

液體石蠟法

亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養基上，最適條件下培養至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進行保存的一種菌種保藏方法。

操作步驟如下：

1. 液體石蠟的準備

選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：

121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。

160℃干熱滅菌2個小時，冷卻后，經無菌檢查后備用。

2. 斜面培養物的制備

參照定期移植法。

3. 灌注石蠟

將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養好的新鮮斜面培養物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。

4. 保藏

4.1　注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態置低溫（4～6℃）干燥處保藏，保藏時間2～10年。

4.2　保藏期間應定期檢查，如培養基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。

5. 恢復培養

恢復培養時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養基上，生長繁殖后，再重新轉接一次。

沙土管法

是載體保藏法的一種。將培養好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室溫進行保存的一種菌種保藏方法。

操作步驟如下：

1. 沙土管制備

將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干或曬干。

另取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩,水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30min。

隨機抽取滅菌后的砂土管若干支，無菌條件下取少許砂土至營養肉汁培養基中，30℃培養24小時，檢查無微生物生長后方可使用。

2 斜面培養物的制備

參照定期移植法。

3 制備菌懸液

向培養好的斜面培養物中注入3～5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。

4 干燥

真空抽去沙土管中水分。

5 保藏

將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4～6℃)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內保存。

保藏時間2～10年。

6 恢復培養

無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養基上，長出菌落后再轉接一次。或取沙土粒于適宜的液體培養基中，增殖培養后再轉接斜面。

真空冷凍干燥法

將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停止，從而長期維持存活狀態。

操作步驟如下：

好氧菌冷凍干燥管的制備

1. 安瓿管準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2. 保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

3. 凍干樣品的準備

在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4. 預凍

一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。

5. 冷凍干燥

采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。

將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。

6. 真空封口及真空檢驗

將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。

熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

7. 保藏

安瓿管應低溫避光保藏。

8. 質量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。

厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同，注意保護劑的選擇和準備，保護劑使用前應在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。

復蘇方法

—— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，

—— 將安瓿管頂部燒熱，

—— 用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，

—— 用無菌水或培養液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養基上，進行適溫培養。

-80℃ 冰箱凍結法

將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。

操作步驟如下：

1. 安瓿管的準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2. 保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

3. 微生物保藏物的準備

在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4. 凍結保藏

將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。

5. 復蘇方法

從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當快速搖動。直到內部結冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。

液氮超低溫凍結法

液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態氮，或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

操作步驟如下：

1. 安瓿管或凍存管的準備

用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2. 保護劑的準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。

3. 微生物保藏物的準備

微生物不同的生理狀態對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養物。

分裝時注意應在無菌條件下操作。

菌種的準備可采用下列幾種方法：

刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；

接種液體培養基，振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；

將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；

在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基，接種菌種，培養2-10天后，加入保護劑，待保藏。

4. 預凍

預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

目前常用的有三種控溫方法：

—— 程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控制降溫速率。

—— 分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。

—— 對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

5. 保藏

將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。

 

6. 復蘇方法

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。